NUCLEIC ACIDS RES丨光化学共价锁稳定适配体构象，并增强其在生物医学中的性能

今天分享近期发表在 Nucleic Acids Research 上的一篇文章，标题为“ A photochemically covalent lock stabilizes aptamer conformation and strengthens its performance for biomedicine  ”。

有关作者：

   本文的通讯作者是中科院院士、化学生物学专家谭蔚泓和湖南大学化学化工学院副教授赵子龙，分别主要研究生物分析化学、化学生物学和化学生物学、纳米生物学。

研究背景：

单链核酸 (ssNA) 适体折叠成特定二、三级结构来识别靶标 ，因含磷酸二酯键中自由旋转单键和碱基配对中动态氢键，使其构象灵活，这导致结合亲和力减弱、脱靶作用及对生物体液中核酸外切酶的敏感性，从而影响适体在生物医学中的性能。

目前已开发促进适体折叠为稳定构象并提高其性能的策略，其中基于酶促或点击化学连接的 ssNA 环化为主要方法，环化适体无 ssNA 自由端，减少错误折叠可能性，增强热稳定性、构象稳定性和结合能力，从而促进适体的应用。但适体构象-性能关系的相关知识较少，且酶促或点击化学较耗时昂贵。因此，需开发通用、简单且经济的策略来解决以上问题。

本文开发一种基于8-甲氧基补骨脂素的光化学共价锁，经紫外线辐射共价交联 5'-TpA 位点的链间胸腺嘧啶核苷酸来稳定适体构象，系统研究和分子动力学模拟探讨了适体的构象-性能关系，揭示了构象稳定的适体具有更好的结合靶点、适应生理环境、抵抗巨噬细胞摄取、延长循环半衰期、积累和渗透的能力，促进了适体在靶向治疗上的应用。

图1 基于8-甲氧基补骨脂素的光化学共价锁通过适配体中TpA位点上链间胸腺苷啶核苷酸交联来稳定适体构象并增强其性能和在靶向治疗中的应用。

结果与讨论：

1.制备光化学共价锁适体PCCL-aptamer

       为制备PCCL-aptamer，将蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)适体Sgc8，转铁蛋白受体的适体HG1-9和胞膜蛋白适体TCO1的5‘/3’末端由四个ApT二核苷酸取代，并在365nm紫外照射进行交联，为8-甲氧基补骨脂素提供了潜在位点。

2.光化学共价锁稳定适配体构象

为研究光化学共价锁可稳定适体构象，将PCCL-Sgc8m，Sgc8m和Sgc8在含1/5 mM Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，通过超离心自旋向下实验，分析它们通过直径为10nm（接近肾小球滤过大小）或200nm孔的能力（在肝和脾脏不连续内皮孔范围内），并测定未过滤和过滤样品中三种适体的百分比，结果显示，与Sgc8m和Sgc8相比，PCCL-Sgc8m滤液荧光信号较低，这表明PCCL-Sgc8m的变形性较低，比Sgc8m和Sgc8更难通过过滤器，即光化学共价锁可稳定适体构象（图 2）。

图2.光化学共价锁定可稳定适体构象

为探索锁定和解锁状态的PTK7 Ig3-4适体分子水平的结合模式，进行分子动力学模拟，与Sgc8m-PTK7 Ig3-4的结合界面曲线相比,PCCL-sgc8m-PTK7 Ig3-4的结合界面曲线有更多氢键（图3），且PCCL-sgc8m-PTK7 Ig3-4的结合能比Sgc8m-PTK7 Ig3-4低约1.4倍（表1），这表明光化学共价锁定适体可增强氨基酸残基间结合强度，进而增强构象稳定性和结合亲和力。细胞结合测定显示，PCCL-sgc8m比Sg8m和Sgc8具有更高结合亲和力，且仍具识别特异性，与PTK7阳性CCRF-CEM/HCT116细胞结合，但不与PTK7阴性K562/HEK293细胞结合。  

综上，PCCL-aptamer更稳定，增强结合亲和力，不影响适体特异性。

表1.通过分子模拟计算得到Sgc8m-/PCCL-Sgc8m-PTK7 Ig3-4的计算结合能

图3.分子动力学模拟PCCL-Sgc8m-PTK7 Ig3-4(A)和Sgc8m-PTK7 Ig3-4(B)的结合相互作用。(C)连接子结构交联位点在适体T-2、T-46

3.PCCL-Aptamer具有更好生理环境适应性，抵抗外切酶、流动剪切应力和非靶向蛋白干扰

为研究适体生理环境适应性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCCL-Sgc8m在外切酶I或胎牛血清中的稳定性，结果显示，PCCL-Aptamer比解锁适体表现出更高稳定性（图4A-B）。

为研究剪切条件下适体-细胞的相互作用，利用锥板粘度计来模拟剪切流环境，在1/5mM Mg2+ DPBS、剪应力为0.2~1.2 Pa的条件下，PCCL-Sgc8m与CCRF-CEM细胞的结合能力比Sgc8/Sgc8m下降慢。这表明，PCCL-aptamer可抵抗流动剪切应力，并与靶标良好结合（图4C）。

为研究光化学共价锁适体对非靶蛋白干扰的抗性，用单链结合蛋白(SSB)在生理环境中模拟非靶蛋白与ssDNA的非特异性结合，结果显示，在2.3 g/mL SSB处理下，PCCL-Sgc8m比Sgc8/Sgc8m处理下的细胞表面荧光信号强度降低幅度小（60％，42％）。这表明，PCCL-Sgc8m可与CCRF-CEM细胞良好结合，且表现出更强抵抗非靶蛋白干扰能力（图4D-E）。

综上，PCCL-aptamer有更好生理环境适应性，抵抗外切酶、流动剪切应力和非靶向蛋白干扰。

图4. PCCL-aptamer对生理环境的适应性优于解锁适体

4.PCCL-aptamer抵抗巨噬细胞摄取，并延长循环半衰期

为评估PCCL-Sgc8m、Sgc8和Sgc8m适体的巨噬细胞摄取，通过分析脂多糖(LPS)预刺激小鼠巨噬细胞RAW 264.7中Cy5标记三种适体对应细胞的内吞作用，结果显示，PCCL-Sgc8m处理细胞中摄取量少于Sgc8和Sgc8m处理，这表明，构象稳定使适体抵抗巨噬细胞的摄取和清除（图5A-B）。

为研究三种适体的体内循环半衰期和生物分布模式，在小鼠尾静脉注射cy5标记三种适体后，测其荧光信号，结果显示，PCCL-Sgc8m循环半衰期是Sgc8和Sgc8m的近2倍（约36.29分钟），这是由于前者构象稳定更难降解（图5C）。PCCL-Sgc8m在器官中有不同分布模式，因其循环半衰期延长和变形能力低，在肾脏和肝脏中有较高积累量，降低其肾脏清除率(图5D-E)。

综上，PCCL-aptamer抵抗巨噬细胞摄取，并延长循环半衰期。

图5. PCCL-aptamer抵抗巨噬细胞摄取，循环半衰期更长

5.PCCL-aptamer有效积累并深入肿瘤

为研究PCCL-Sgc8m、Sgc8和Sgc8m适体在肿瘤中的积累，在HCT116带瘤的BALB/c裸鼠尾静脉注射cy5标记适体，体外成像显示，三种适体在肿瘤中均有效积累,且PCCL-Sgc8m在肿瘤中保留时间最长（6h)。这表明，PCCL-Sgc8m更有效地识别、积累在肿瘤中（图6A）。

接着研究三种适体在肿瘤中的穿透，分析480微米范围内肿瘤组织切片荧光信号，结果显示，随Sgc8和Sgc8m适体处理的肿瘤小鼠切片沿Z轴的深度增加，荧光信号逐渐减少，但PCCL-Sgc8m处理的肿瘤小鼠各部分各截面深度上都观察到强红荧光信号，这表明，PCCL-Sgc8m可深入穿透肿瘤。（图6B）

为进一步分析肿瘤血管周围cy5标记适体的红色荧光信号，用绿色荧光信号标记，Sgc8和Sgc8m适体处理仅在肿瘤血管附近观察到红色荧光信号，PCCL-Sgc8m处理在远离肿瘤血管处观察到明显红色荧光信号。这表明，PCCL-Sgc8m通过毛孔变形率小，但更深入渗透到肿瘤中（图6C-E）。

综上，PCCL-aptamer在肿瘤中更多积累和深层渗透，即获得高药物浓度。

图6.经尾静脉注射Cy5标记的Sgc8、Sgc8m和PCCL-Sgc8m后，不同时间点的HCT116荷瘤小鼠的体内全身荧光成像、一系列肿瘤组织切片成像、肿瘤中血管外扩散的荧光成像分析

6 .PCCL-aptamer提高适配体-药物偶联(ApDC)对小鼠的治疗效果

   为探究PCCL-aptamer对适配体-药物偶联(ApDCs)体内治疗效果的影响，

经点击化学将DBCO-Sgc8m与CA4-PEG3-氮化物偶联，并与8-甲氧基补骨脂素进行光化学交联，合成PCCL – aptamer– CA4偶联物（图7A）。

为评估游离CA4、CA4-PEG3叠氮化物、Sgc8m-CA4和PCCLSgc8m-CA4对PTK7阳性HCT116细胞和PTK7阴性HEK293细胞的细胞毒性，结果显示，游离CA4对两种细胞均有较强非选择性细胞毒性，PCCL-Sgc8m-CA4比Sgc8m-CA4对HCT116细胞有更强细胞毒性，均低于游离CA4，但均对HEK293细胞有较弱的细胞毒性，这表明PCCL-Sgc8m，Sgc8m可提高药物选择性并减少不良反应（图7B）。

为进一步评估体内治疗功效，分别向小鼠体内注射DPB，CA4，Sgc8m – CA4，PCCL-Sgc8m-CA4，结果显示，DPB处理小鼠肿瘤快速生长，CA4和Sgc8m-CA4处理表现出轻微抗癌活性，肿瘤体积明显减小，PCCL-Sgc8m-CA4显示最高抗癌活性，使肿瘤体积缓慢增加，这表明PCCL-Sgc8m-CA4显著引起肿瘤细胞凋亡,但对主要器官几乎无不利影响。（图7 F-G）

综上，PCCL-aptamer增强ApDC体内治疗功效，且对正常器官毒性很少。

图7. PCCL-aptamer提高ApDC对荷瘤小鼠的治疗效果

总结：

本文开发一种简单经济，高效，不需特殊化学修饰，阐明适体构象-性能、结构-功能的关系的光化学锁定策略，通过在TPA部位胸腺嘧啶核苷酸间交联稳定适体构象，从而增强结合能力，生理环境适应性，以抵抗各种干扰并积聚渗透到肿瘤中，可作为稳定适体构象的一般策略，促进适体在生物医学中的应用。

Fang Zhou, Peng Wang, Jianghuai Chen, Zhijia Zhu, Youshan Li, Sujuan Wang, Shanchao Wu, Yingyu Sima, Ting Fu, Weihong Tan, Zilong Zhao, A photochemically covalent lock stabilizes aptamer conformation and strengthens its performance for biomedicine,

Nucleic Acids Research,2022;,gkac703, https://doi.org/10.1093/nar/gkac703