韩 达 课 题 组

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NAT COMMUN丨一种在分子水平上对蛋白质相互作用进行布尔分析的方法

大家好,今天分享的文献是2022年8月发表在nature communications上的“一种在分子水平上对蛋白质相互作用进行布尔分析的方法”。

有关作者:

 

本文作者是瑞典乌普萨拉大学药物生物科学系的Ola Söderberg教授,主要研究方向为研究细胞生物学新工具与新方法开发,以及这些新方法在基础研究中的应用。

该课题组发明了原位邻近连接分析(in situ PLA),并将其用于多重蛋白质和 mRNA 的同时测量。本文是一种新的原理类似于PLA的检测各种亚细胞区室中内源蛋白之间相互作用的方法(MolBoolean)。

研究背景:

In situ PLA (原位邻近连接分析) 

 

确定蛋白质-蛋白质相互作用的水平对于分析细胞内的信号传导,理解蛋白质功能和疾病中的异常活化至关重要。Ola Söderberg课题组在2006年开发的 In situ PLA为单分子分辨率下观测蛋白质-蛋白质相互作用提供了可能,实现在人类细胞系和临床标本中观察和计数单个相互作用的蛋白质分子对。

后续对PLA进行了各种改进,包括同时引入不同浓度的DNA环变体和对应荧光的reporter,以实现对任何目标蛋白的合适检测灵敏度的检测;以及引入compaction oligonucleotide来压缩RCA产物,减少其分裂成簇影响信号的后续处理等。

In situ PLA (原位邻近连接分析) 的缺陷

In situ PLA主要是通过RCA放大信号的,而当RCA的产物(RCP)在原位累积时,直径可达0.8μM,RCP的合并会导致无法识别出其中单个的信号点,从而限制单个细胞中目标PPI的量化。当表面蛋白丰度较高的时候,可能误采到没有相互作用的信号。因此为了使此类方法生成的数据更可信,不仅要获得有关有相互作用蛋白的信息,还要获得可用于标准化数据的游离蛋白质数量的信息。

整体设计:

 

在本篇文章中,作者开发了“MolBoolean”,通过分子水平上的布尔逻辑运算,在报告蛋白质A, B相互作用(AND)的同时,也报告了不参与相互作用 (NOT) 的蛋白质 A 和蛋白质 B 的数量。

与in situ PLA 类似,MolBoolean 也依赖于使用邻近探针和滚环放大 (RCA) 作为产生和放大信号的手段。基本原理是,一对抗体与其蛋白靶标结合,偶联DNA的二抗作为arm,与一个环状DNA的特定区域互补,以此特定的环状DNA作为信号接受器,每当信息接收器圈和邻近探针中的互补区域杂交时,切口酶识别该特定序列并切割其中一条链(环状DNA)。存在相互作用时,产生两个切口,仅有一个蛋白时,产生一个切口,接着对应靶标数量的“tag”链与原本探针上的stem-loop互补,使之展开,被整合进入接收器(环状DNA中),被T4连接酶连接,下一步通过RCA反应,形成长的串联 DNA 产物。然后将这些 RCP 与荧光团标记的标签特异性检测寡核苷酸杂交,以差异化地显示插入标签的身份。单标记的 RCP 代表游离蛋白质,而双标记的 RCP 代表相互作用。

结果与讨论:

1,在溶液中的MolBoolean 特异性测试:

 

为了验证 MolBoolean 方法中酶促步骤的特异性,作者首先在溶液中进行了实验,以确保arm与环状DNA 的杂交为Nickase提供了模板,并且标签tag特异性地掺入了切口 DNA 环中。并且标签tag仅在对应的arm与DNA环杂交的情况下被连接进环内,这表明标签合并取决于邻近探针的所对应的靶标蛋白。

2,单一蛋白质靶向和抗体验证

 

MolBoolean 的设计目的是同时完成对于自由蛋白和相互作用蛋白的同时观测。作者使用两种针对蛋白质不同表位的抗体共同染色细胞,此时一抗的特异性决定了验证效果,针对同一靶蛋白的两种抗体是否同样擅长结合,以及它们与其他蛋白质是否存在交叉反应。实验表明 MolBoolean 染色两种针对 β-catenin的抗体(种属不同)的成像pattern与PLA以及IF高度相似。

3, E-cadherin 与 β-catenin的MolBoolean 分析

 

为了验证MolBoolean对于相互作用的检测,作者在各种条件下对 E-cadherin与β-catenin进行染色。作者在表达 E-cadherin和β-catenin的MCF7 细胞与不表达E-cadherin的生物对照(U2OS 细胞)进行染色。

在 MCF7 细胞中,作者观察到细胞质中的游离蛋白质,以及质膜中相互作用的特定蜂窝模式,反映了两种蛋白质在粘附连接中的共定位。在骨肉瘤细胞系 U2OS 中,仅检测到游离β-catenin。同时,作者设置了无相互作用的对照,E-cadherin 和Lamin A/C (主要定位于核纤层),两种蛋白质之间几乎不会发生相互作用。

4,padlock probe设计和固定细胞中的应用

 

为了验证在E-cadherin-β-catenin 染色中观察到的双色RCA 产物包含两个tag,而不是位置靠近的两个单色 RCP,作者设计了针对 MolBoolean 邻近探针的padlock探针。padlock探针由两个目标互补段组成,在识别目标 DNA 序列后,探针的 5' 和 3' 端可以通过与 T4 连接酶的连接,产生可通过RCA扩增的环状 DNA。如果是两个点overlap,那padlock也应该有类似现象,如果没有,说明检测到的点确实是蛋白相互靠近造成的。经过图像的量化、归一化和比较显示 MolBoolean 中每个细胞的复合物比例明显高于MolBoolean padlock实验。

5,MolBoolean 分析不同情况下蛋白质状态的动态变化

 

接下来,为了验证MolBoolean 方法可以特异性地可视化相互作用的蛋白质,作者检测了在 E-cadherin的β-catenin 结合位点具有致病性错义突变 (V832M) 的细胞中,两种蛋白相互作用的减少。作者观察到细胞聚集减少和复合物形成显着减少,而游离E-cadherin的水平保持稳定。

 

在证明 MolBoolean 有效地观测到丰度较高的蛋白质复合体,作者想进一步探索该方法在检测一种相互作用的同时,对于一种蛋白减少的情况下的灵敏度和特异性。

作者对 HaCaT 细胞中的 PDIA3和钙网蛋白进行了染色。与对照相比,在PDIA3 敲低细胞中检测到游离 PDIA3 显着减少,以及蛋白质相互作用的降低,原位 PLA 证实了沉默后相互作用的统计学显着降低。

6,MolBoolean 分析各种细胞区室中的蛋白质

 

为了证明MolBoolean 可用于定量限制在细胞“拥挤”区室中的游离和相互作用蛋白质,作者对 MCF7 细胞染色 Emerin(EMD)和 Lamin B1(LMNB1)。MolBoolean 染色显示了核膜中的重要相互作用区域。

7,MolBoolean 分析组织切片中的蛋白质

 

为了验证该方法不仅可以成功地用于细胞,还可以用于组织应用,作者针对 ACE2 及其相互作用蛋白 TMPRSS2 对肾组织进行染色。作者分析证明了其在近端肾小管细胞中的特征性膜表达和与 TMPRSS2 (一种丝氨酸蛋白酶)的强共定位(图 8a)。

此外,作者应用MolBoolean 来检测结肠组织中的 SATB2 和 HDAC1,证明了结肠粘膜腺细胞核中两种蛋白质之间相当高水平的共定位,伴随着 HDAC1 和 SATB2 的高水平游离蛋白质。

总结:

1, 这项工作说明了,MolBoolean适用于细胞和固定的组织样本,可以同时灵敏地检测游离蛋白和有相互作用的蛋白。同时,这种方法类似于已报道的in situ PLA或者FRET,都是基于临近距离给出的检测信号,而不是蛋白质相互作用的绝对证据

2, 与所有免疫染色方法一样,MolBoolean 取决于所用抗体的质量。需要对抗体特异性进行严格验证,以确保抗体实际上靶向其预期的蛋白质,应该旨在使尽可能多的表位饱和,以免损害双信号检测。

3, 由于 RCP 的离散性、点状性质,与常规免疫染色技术相比,MolBoolean 中的信号强度不仅被放大,而且还允许量化 RCP 的数量、合理时的标准化以及不同条件之间的比较,提供有关蛋白质相互作用的信息,但也提供有关单个蛋白质的相对数量的信息

2022年8月27日 16:08
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