NAT CHEM | 用于远非平衡化学网络的可扩展工程的标准化可激发元件
大家好，今天给大家分享一篇由约翰斯·霍普金斯大学Rebecca Schulman教授团队发表于Nature Chemistry上的研究文章《Standardized excitable elements for scalable engineering of far-from-equilibrium chemical networks》，其第一作者是该团队已毕业博士Samuel W. Schaffter。
应激反应和形态发生等细胞过程通常由遗传网络(GRN)调控，这些网络通过持续消耗能量来实现远离反应平衡以运行。远离平衡的合成化学网络可以响应环境信号而脉冲或切换状态，可用于精确地调节化学合成或自组装的动力学。目前，现有的设计必须对此类网络进行大规模调整优化，以补偿网络中各种化学成分的不同活动和意外反应。因此，具有标准化性能的模块化元素可用于快速构建具有设计功能的网络。
此前，该作者曾在Nature Chemistry发表研究文章《Building in vitro transcriptional regulatory networks by successively integrating multiple functional circuit modules》，详述了使用Genlet构建体外功能电路模块，并建立了定量模型用于描述不同的功能体系，使其更好地为实验优化提供理论指导。
在最新的工作中，作者开发了被称为Genelet的标准化可激活的化学调节元件，并使用它们构建复杂的体外转录网络。作者通过对体系模块中所用的基础元件Node进行标准化：使用NUPACK进行计算机辅助的序列设计，结合实验对Node的反应行为进行筛选，建立了一个具有统一性能和最小串扰的可互换Genelet的标准化元件Node的文库，这些元件可以结合起来设计前馈和反馈模块，其动力学与简单动力学模型所预测的相匹配。此外，可将模块合理地集成并组织成产生可调时间脉冲并充当多态可切换存储器的网络，用于任意功能模块及复杂网络的构建。
在Node的设计中，作者使用了Genelet作为其核心组成部分。Genelet是一种人工合成的小型DNA基因开关，仅通过T7 RNA聚合酶和核糖核酸酶H来控制RNA效应分子的产生和降解。因此，凭借这种简单可调控反应行为的Genelet作为动态网络的基础元件，可用以搭建体外生化电路，并易于对其进行定量模型搭建。
为了筛选出符合标准的Node，作者首先使用NUPACK 3.2.2设计了36个Genelet输入-输出序列的序列，这些序列预测在其设计的发夹结构中都是热力学稳定的，并且与彼此节点的非设计交互作用最小。除了正交性之外，作者还寻找可以以相似速率完全激活或抑制的序列，从而得到一个通用的Genelet行为模型（假设每个节点的反应速率相同），用以可靠地指导网络设计。DNA激活序列或阻断序列的使用量超过了它们各自的Genelet，因此预期可完全激活或阻断。Genelet调控的速度应受四向分支迁移率的控制。先前报道的四向分支迁移的速率常数范围为103~104 M-1s-1，表明25 nM Genelet的响应信号大于0.9的部分应在15-100分钟内被激活。因此，作者通过实验筛选出了1小时内响应激活到大于0.9的序列。作者依据这种筛选标准对了不同序列的速率分布进行分类，并且这些速率对应的序列具有相似性，使得所筛选得到的候选对象遵循一般Genelet模型的预测规则。
作者接下来通过在DNA阻断序列或激活序列之外添加DNA共激活序列或阻遏序列来监测这一开关的变化，测试了通过DNA激活筛选的16个Node的共激活和抑制动力学。当由DNA共激活序列和阻遏序列切换时，所有初筛的Node均在小于1小时内达到大于0.9 ON/OFF。但在监测响应RNA共激活因子或阻遏序列转录的转换速率时，许多Node转换不完全或至少比响应相应DNA序列的速度慢2倍，且改变RNA调节转录模板的浓度并没有加速响应较慢的Node，这表明并非由于转录率的差异导致的缓慢，而是因为不完全的RNA转录或RNA错误折叠。
为了测试进一步筛选得到的Node的输入和输出域是否可以互换使用，作者测试了28 个独特的输入-输出组合共同激活或抑制下游报告基因的速率。这些组合中有27个在小于1 小时将其目标切换到大于0.9 ON/OFF，这表明输入域的选择对下游调节的速率没有太大影响。最终，作者得到了一个标准化的Node文库，用于进行后续复杂网络的设计和构建。
接下来，作者研究了其确定的标准化Node是否可以整合到监管网络中，其动态可以使用Genelet动力学的一般模型进行预测和编程。该模型由常微分方程组成，并假定每个Node的动力学速率常数相同，用以描述给定网络架构设计Genelet反应的质量作用动力学。作者使用该模型设计了不连贯前馈回路 (IFFL)模块，这些模块通过协调的共激活和抑制产生Genelet激活脉冲。为了测试Genelet Node是否可以在IFFL中互换，作者使用文库中的其他Genelet Node构建了额外两个IFFL模块，并使用与IFFL1中相同的浓度测量它们的脉冲动态。所有三个模块（IFFL1、IFFL2和IFFL3）都表现出与模型预测一致的脉冲动力学，证明标准化的Node可用于构建预测的反应网络。
接下来，作者验证了可以将多个IFFL模块连接到一个复合网络中，模型预测该复合网络会产生连续脉冲，而实验结果表明所设计的符合网络可产生连续可调的脉冲。随后，作者设计了由三个互锁互抑制双稳态模块（BSM1-3）组成的TSN，用以验证可将标准Genelet重组为具有可预测行为的反馈网络。最后，作者验证了可将前馈和反馈模块集成到更大的复合网络中，通过组件模块的行为来预测其动态。这些结果均为单个Node和更大模块的正交性提供了令人信服的证据。
此外，为了促进其他网络的组装，作者还开发了一个开源Python包，用于模拟具有不同拓扑、初始条件和物种浓度的网络，自动为给定的拓扑生成适当的标准化基因序列。
综上而言，作者描述了一种筛选具有标准性能的部件的方法，通过集成和重组文库中的元件使得大规模的动态行为设计成为可能。这种工具包构建的网络可以根据环境线索选择或切换多种合成途径，模拟细胞代谢的反应性化学调节，自主处理和传输化学信息，组织、维持或转变化学反应扩散模式。
Ref：
Schaffter, S.W., Chen, KL., O’Brien, J. et al. Standardized excitable elements for scalable engineering of far-from-equilibrium chemical networks. Nat. Chem. (2022). https://doi.org/10.1038/s41557-022-01001-3
