NATURE丨通过CRISPR添加retron条形码记录DNA中的基因表达顺序

大家好，今天给大家分享的文章是来自加利福尼亚大学旧金山分校Seth Shipman组发表在Nature上的工作，题目是《通过CRISPR添加retron条形码记录DNA中的基因表达顺序》。

DNA是细胞生命的通用存储介质。近年来，一个新兴的生物技术领域已经开始重新利用 DNA 来存储没有细胞功能的信息。DNA 具有高信息密度、易于复制和耐用的特点，因此可以用于灵活地存储文本、图像和声音。本文作者拓展了这一存储概念，开发了在活细胞中进行数据存储的系统，允许将生物信号记录到 DNA 中，即将内源性转录和环境刺激记录到基因组DNA中。

在这份工作中，作者使用CRISPR/Cas体系将Retron整合到基因组内来进行转录先后顺序的记录。Retron具有尺寸紧凑、特异性和灵活性的特点，其可在体内产生可定制的 DNA，因此成为生物技术的有吸引力的工具。既往研究显示Retron 已被用于多个应用程序中。通过结合逆转录酶和 CRISPR-Cas 整合酶的功能，作者建立了一个系统来对转录事件进行时间记录。为了记录转录事件，作者设计了 Retrons 以产生一组紧凑的、特定的分子标签，这些标签可以置于单个细胞内多个诱导型启动子的控制之下。当标记的启动子处于活动状态时，标记序列被转录成 RNA 并由逆转录酶 (RT) 逆转录以生成 DNA 转录“收据”。然后该 DNA 接收被 Cas1-Cas2 绑定并整合到细胞的 CRISPR 阵列中，从而创建永久的转录记录。如果另一个标记的启动子随后变得活跃，则可以在第一个间隔子之后生成不同的 DNA 接收并整合到 CRISPR 阵列中。通过在基因组中生成这些收据的线性记录，作者构建了一种生物装置，并称之为 Retro-Cascorder，它将特定基因表达事件的时间历史记录到单个细胞的 CRISPR 阵列中（图1a，1b）。作者首先验证改造野生型Retron EC1后，其msDNA能在大肠杆菌中正常表达，并通过红霉素诱导型启动子证实v32和v35突变型Retron能在RT逆转录酶表达后在大肠杆菌中生产；作者进一步证实Retron 序列保守位置a1/a2 stem长度在27bp是产生的msDNA最多。在前期Retron msDNA产率最大化调整工作完成后，作者决定使用a1/a2 stem长度为27bp、v35型Retron并结合Cas1/Cas2进行转录事件的记录（图1）。

图1. Retron体系用于转录事件记录的条件摸索。

接下来作者将Retron DNA loop部分序列该换成8种不同的序列以探索测序技术是否能区分出这不同的8中序列，结果显示loop部分的序列至少需要4个碱基以上的差异才能被测序识别，硅基运算模拟进一步证实了这一结果（图2）。

图2.基于Retron的条形码的多样化。

既往研究表明 Cas1-Cas2 可以将由两条互补 DNA 链组成的前间隔物整合到 CRISPR 阵列中，但最新的证据表明 Cas1-Cas2 能够结合单链 DNA（ssDNA）并且实际上可能结合以逐步的方式分开两股预间隔物。因此作者使用Retron体系进一步探索了Cas1/Cas2获取Retron msDNA后以何种方式整合到基因组CRISPR阵列中（图3）。

图3. Cas1/Cas2整合RT-DNA机制探索。

作者接着采用胆碱和四环素诱导型启动子验证转录事件的先后顺序是否可以通过Retron体系进行记录（图4），并探索了Retron记录体系的限制性（图5）.

图4. 基因表达的瞬时记录。

图5. 模拟 Retron 记录的极限。

在这里，作者描述了一个用于记录和重建细胞群中转录历史的系统，称之为 Retro-Cascorder。作者通过设计一个 RNA 分子标签来实现这一点，该标签被专门逆转录以产生转录的 DNA 接收，该转录永久保存在 CRISPR 阵列中。通过修改retron ncRNA的结构使记录retron更有效，展示了这些工具持续开发的灵活性和潜力，并开发了一个条形码retrons工具包，以供将来应用于更复杂的系统。除此之外，作者还研究了该能力CRISPR 适应系统使用 RT-DNA 作为前间隔子并发现retron 2'-5' 连接导致获得的间隔子类型存在显着差异。最后，作者使用该系统记录和重建细胞群中按时间顺序排列的生物事件，并开发了一个retron记录计算模型，以更全面地探索系统的局限性。