ANGEW丨由细胞内DNA纳米框架的质子驱动动态组装实现的溶酶体干扰
大家好，今天分享的文献是2022年6月由Angewandte Chemie International Edition接收的一篇文章《Lysosome Interference Enabled by Proton-Driven Dynamic Assembly of DNA Nanoframework inside Cells》。
有关作者
本文的通讯作者是来自于天津大学化工学院的仰大勇教授。仰教授课题组以生物大分子DNA为研究主线，聚焦于DNA生物功能材料智能制造，理解生命系统运行机制，探索重大疾病的诊断治疗新途径。
研究背景
溶酶体是是一种单层膜包被的囊泡样细胞器，参与生物大分子的处理与循环、细胞内物质的降解等重要的生理和病理进程。外界物质进入细胞的过程有多种，以网格蛋白介导的内吞作用为例，外界货物会进入内涵体，亦称内体中，初级内体将成长形成次级内体，且不断融合同类型的内体成为更大的囊泡，次级内体或以多泡体的形式呈现，最终与溶酶体融合。作为重要的“细胞回收站”，溶酶体是一个充满60多种酸性水解酶的酸性腔室，在上述成熟的过程中，其腔内pH逐渐降低至4.5~5.0左右，这种酸性环境主要有赖于溶酶体膜上空泡型H+-ATP酶（v-ATP酶）将氢离子泵至腔内。
人为干预溶酶体功能及其微环境对于调控细胞行为有着重要作用。已经有多种药物被证实能干预溶酶体环境，譬如氯喹（CQ）作为一种亲溶酶体的弱碱物质，能够在腔内累积，增加溶酶体内的pH值，使用CQ便可阻断蛋白的自噬降解。巴佛洛霉素则是选择性抑制溶酶体膜上的v-ATP酶，阻止其将H+泵入溶酶体腔内，这样做便可以抑制自噬流。但尽管有这些办法，它们依旧面临着不小的缺点，比如不能选择性靶向特定细胞、可能有毒性、可能会与非溶酶体成分进行相互作用……因此研究者们也将目光转向探索能够通过溶酶体内部酸性这一环境进行动态变化，从而特异性调控溶酶体的细胞学手段。比如2020年Nature Nanotechnology上发表的一篇文章，研究者们设计了一种进入树突细胞溶酶体后，在质子驱动下可由球形变为层状的纳米变形装置，这种形态学上的改变将扰乱内涵体的膜结构，使得纳米装置上装载的抗原肽进入细胞质内，成为一种更高效的纳米疫苗载体。另一篇Nature Nanotechnology上的文章，则是将纳米材料干预溶酶体功能运用在了癌症治疗中，该研究团队发现混合电荷的纳米颗粒在正常细胞与癌症细胞之间，倾向于在pH更低的癌症细胞溶酶体中聚集，并在其中结晶化，使其不能被排出，最终导致癌症细胞溶酶体肿胀，诱导细胞死亡。而本次要分享的文章作者仰大勇教授团队，也曾在Angew上发表过类似方向的文章：纳米颗粒进入细胞后遇到溶酶体内酸性环境，从而经历拓扑变形，变为如同细胞器一般的水凝胶结构，并能够促进细胞迁移。在这篇文章中，仰教授用到了i-motif这一结构，在今天介绍的文献中也会作为主角出现。i-motif序列，亦称嵌入基序，是一种是富含胞嘧啶的DNA结构，在酸性环境下，i-motif中的胞嘧啶会被质子化，从而折叠形成一种四链四元的DNA结构。
因此，本文作者的基本研究思路便是通过HCR，将大量半i-motif序列整合至DNA纳米框架中。该纳米结构被细胞内化后进入溶酶体，在溶酶体的酸性环境中，相近的纳米结构因为半i-motif结构的质子化效应，从而形成聚集体，使得纳米装置在溶酶体中更久地滞留；同时，质子化效应本身也会削减溶酶体中的酸性与酶活性，使得核酸药物能够免受核酸酶的降解。
研究结果
图1 胞内质子驱动NDHi的动态组装方案
首先是研究者们对于分子的设计。作者将N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、3-丙烯酰胺苯基硼酸（3-AAPBA）、N, N亚甲基双丙烯酰胺（Bis）和丙烯酰胺修饰DNA （acDNA）等四种单体沉淀聚合，制备了NIPAM聚合纳米骨架（NF）。制备的NIPAM纳米骨架以饱和碳链为主要框架成分，并辅以Bis和acDNA作为交联剂，以保证网状结构的形成。3-AAPBA负责调控NF颗粒大小，并以细胞表面的唾液酸残基为靶点，通过受体介导的内吞作用增强整个结构的细胞内化（图1A）。为了促进DNA在高分子NF中的结合，作者在acDNA上设计了伸出部分作为诱导，触发两种发夹结构Hi和HA的杂交链式反应（HCR），并最终生成NIPAM-DNA纳米框架（ND）。在没有acDNA存在的情况下，两个发夹结构会保持相对稳定的构象。在acDNA存在的情况下，acDNA的伸出部分将与Hi发夹结构的3 '端toehold互补，这可以促使Hi打开并暴露loop区域。随后，打开了的loop区域又可作为HA 5 '端toehold的互补序列，从而促进HA发夹结构的打开。Hi和HA通过toehold介导的级联HCR和链迁移反应，最终交替杂交形成长链DNA。作者又将半i-motif序列（5'-CCCCTAACCCC-3 '）集成到Hi中，从而获得NDHi。由于相邻的NDHi之间可形成完整的i-motif结构，而i-motif序列可以在酸性条件下通过胞嘧啶质子化折叠成四链结构，因此NDHi理论上具有酸性条件下触发动态组装的特点（图1B）。作者也通过在NF中引入加扰序列设置了一种NDHi的阴性对照，即无法触发酸性条件下组装的NDHni。理论上，NDHi被细胞内化后，将历经不同的微酸性隔室结构（pH ~6.0），最终通过囊泡融合进入溶酶体（pH ~5.0），并在溶酶体的酸性环境中，触发NDHi形成聚集体，从而实现溶酶体干扰（图1C）。
图2 NF与NDHi的制备
发夹结构Hi和HA可通过acDNA诱导触发的HCR装载至NF中，从而合成NDHi（图2A）。在明确了这样的设计后，研究者们着手合成目标装置并行验证。结果显示，合成后的NDHi保持在12% PAGE胶电泳孔道的最上方，相应的发夹结构带比对照带灰度值更低，提示Hi与HA两种结构已成功装载至NF上，且随着合成反应时间的延长，装载效率不断增加，当反应持续24 h时，HA的负载率达到76.6%，因此后续实验将采用24小时的反应时间以制备NDs（图2B）。发夹结构的加入会大大延长DNA交联的长度，进一步增加NF的孔径，因此研究者们进一步探索了NF和NDHi的粒径与形态。扫描电镜图像显示，NF和NDHi皆呈球形，尺寸均匀，且NDHi的分散性优于NF（图2C）。NF和NDHi的大小分别为176±14 nm和220±14 nm（图2D）。NF的水合粒径为242±53 nm，聚合物分散性指数（PDI）为0.349；NDHi的水合粒径为290±52 nm, PDI为0.336（图2E）。磷元素为DNA的特征元素，作者还采用X射线能谱分析仪对其进行分析，结果显示，磷元素主要集中在NDHi的外层，呈现出异质性的纳米结构（图2F）。以上结果共同验证了作者们在NF基础上成功、高效地装载了Hi和HA。
图3 质子驱动的NDHi组装
作者接着用圆二色性光谱对半i-motif在不同pH下的组装进行了表征。作者选择不同的pH值模拟不同的胞内环境，包括正常生理环境（pH ~7.4）、早期内体（pH ~6.5）、晚期内体（pH ~6.0）和溶酶体（pH ~5.0），以及NF制备条件（pH 8.0）。i-motif在~287 nm处为正峰，在~257 nm处为负峰。当pH在8.0 ~ 6.5的范围内变化时，峰值几乎没有变化；但当pH降低到6.0时，正峰出现轻微的红移，而负峰红移至248 nm，但这仍不是i-motif的特征峰；当pH值为5.0时，正峰和负峰分别红移至287 nm和257 nm；这些结果提示在pH为5.0时会特异性发生质子驱动的半i-motif组装（图3A）。为进一步验证这一点，研究者们又将NDHi和作为对照的NDHni在pH 5.0和pH 8.0的条件下用双链DNA特异性染料SYBR Green I染色，结果显示，只有当pH=5.0时，NDHi的荧光图像显示处块状绿斑，其它条件下则没有（图3B）。扫描电镜图像显示，在pH为8.0 ~ 6.0时，NDHi分散性较好，呈球形结构，在pH为5.0时则会组装成微米级聚集体；此外，为验证pH变化是否能逆转纳米装置的组装，研究者们将pH从5.0再次调整到7.4，结果显示NDHi由聚集再度分散成均匀的球体（图3C）。这些结果表明，i-motif赋予了NDHi在特定pH下触发的可逆组装。
图4 NDHis的细胞摄取、溶酶体共定位和酸性条件触发的溶酶体内动态组装
在合成并表征纳米装置NDHi后，研究者们检测A549细胞（人非小细胞肺癌细胞）对NDs的摄取。流式分析显示，细胞对Cy5标记的NDs的摄取随时间增加，并在10 h逐渐达到平衡，且NDHni和NDHi在摄取上的差异可以忽略不计（图4A）。研究者们在此基础上进一步探究了NDs进入细胞的内吞作用途径：他们在将NDs与细胞共同培育前，选择不同的内吞途径抑制剂对细胞进行6小时的预处理，包括氯丙嗪（CPZ）用于抑制网格蛋白介导的内吞作用（CME），制霉菌素（nystatin）用于抑制小窝蛋白介导的内吞作用（CvME），阿米洛利用于抑制巨胞饮作用。荧光图像结果显示，除CPZ处理组外，阿米洛利和制霉菌素处理的细胞摄取效率显著降低，分别下降到了28.6%和54.8%（图4B）。这提示NDs的胞吞途径以巨胞饮为主，CvME次之。接下来，研究者们验证了NDs和溶酶体随时间的共定位。共聚焦图像显示，NDs在2 h时首先粘附在细胞膜表面，在4 h时与溶酶体有良好的共定位效果（图4C & S14）。因此，研究者们后续将继续沿用4小时这一孵育时间点。
为进一步明确NDHi是否进行了细胞内组装，研究者们进行了基于荧光共振能量转移（FRET）的检测。他们分别用Cy5作为荧光基团和BHQ2作为淬灭基团修饰一对NDs（分别称为NDF和NDQ）。当NDHiF和NDHiQ相互接触组装时，荧光被淬灭，呈“OFF”状态；当未发生接触组装时，荧光保持不变，为“ON”状态（图4D）。共聚焦显微镜图像显示，对照组NDHniF的荧光强度明显强于实验组NDHiF，说明NDHi在细胞内发生了组装聚集（图4E & F）。
图5 NDHi在溶酶体中与细胞中的滞留
在进行了一系列对于纳米装置可行性的验证后，作者们转而将NDHi应用于细胞中。研究表明，在细胞内原位形成的大尺寸聚集体可以有效地减少细胞的外排，从而导致该结构的细胞内滞留；因此，研究者们提出假设：溶酶体内部质子驱动下的结构组装可能会表现出增强的溶酶体内滞留效应。为了验证这一假设，研究者们通过共聚焦显微图像评估了与细胞共同孵育12小时后Cy5标记的NDs与溶酶体的共定位程度。NDHni处理后的细胞中呈现出分开的红色和绿色荧光；而在NDHi处理的细胞中有明显重合的黄色荧光信号，提示NDHi和溶酶体共定位，即在12小时的孵育后，NDHi聚集物仍然存在于溶酶体中（图5A & B）。Pearson系数显示NDHi与溶酶体的共定位程度优于NDHni（图5C）。另外，对图5A和5B中白色切线对应的位置进行定位分析，进一步证实了NDHi的组装显著提高了溶酶体内的滞留（图5D & E）。接着，研究者们通过流式分析探索NDHi在细胞内的滞留。他们先将A549细胞与Cy5-NDs孵育2 h，然后在去除NDs的新鲜培养基中继续培养一定时间（0、12、24 h）。一般来说，大多数纳米材料在内吞后都经历了降解或胞吐的过程，因此，细胞中Cy5-NDs的荧光强度在2+0这一时间点前达到峰值，并随着新鲜培养基中的再孵育时间延长而逐渐降低；但是，当再孵育12 h时，Cy5-NDHi和NDHni处理的细胞的荧光强度有显著差异，提示大量聚集物有效地阻碍了胞吐过程；随着再孵育的进行，NDHi处理细胞的荧光强度衰减到与NDHni相当的水平，这可能是胞吐和细胞增殖两种作用下导致的结果（图5F）。总而言之，NDHi聚集物可延迟胞外分泌，延长胞内滞留时间。
图6 NDHi动态组装引起的溶酶体干扰
在证明了溶酶体中的pH响应性组装之后，研究者们进一步探索了质子驱动组装对溶酶体的影响，包括溶酶体的酸度、内部水解酶活性和溶酶体内货物的降解程度。NDHi的组装需要胞嘧啶的质子化，会消耗溶酶体中的H+；因此，研究者们推测质子驱动的组装可能会影响溶酶体的酸性。为了评估这一点，作者们选择了LysoSensor绿色染料（一种pH依赖性探针）来染色溶酶体，染料的荧光强度随酸性的增加而提升。共聚焦图像显示，NDHni处理4 h后的A549细胞中LysoSensor的荧光强度明显强于NDHi处理的细胞，这提示质子驱动的组装显著中和了溶酶体的酸性（图6A & B）。由于大多数溶酶体中的水解酶仅在酸性环境中表现出较高的酶活性，因此调节溶酶体内的酸性可能会减弱这些水解酶的活性，而酶活性的减弱可能将进一步影响递送货物的降解程度。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是一种溶酶体水解酶，主要负责在最佳的酸性pH下水解磷酸键。研究者们便通过萘酚-重氮盐偶联法评估TRAP活性，结果显示，与NDHni处理的对照组细胞相比，NDHi处理4 h后的细胞TRAP活性水平较低，提示水解酶活性减弱（图6C & D）。此外，为了探索水解酶活性对NDs生物降解的作用，研究者们还利用生物透射电镜（Bio-TEM）评估了NDs在溶酶体中的降解程度。多层体（MLB）是溶酶体中内吞物质降解的主要腔室，也被称为晚期溶酶体，具有典型的同心膜环特征。在NDHni处理4 h后的细胞中，纳米装置的颗粒分散在晚期溶酶体中，并在释放到溶酶体液泡（LV）之前几乎完全降解（图6E）。而在NDHi处理的细胞中，能够在自噬溶酶体（AL）中观察到分散的NDs，且NDHi的聚集主要发生在MLB中，并诱导MLB肿胀；此外，在被排放至LV前，还能够观察到一些NDHi残基（图6F）。这些结果共同提示酶活性降低对物质降解具有一定的抑制作用，且NDs的转运途径可以总结为：NDs首先通过与早期溶酶体（Lys）融合的内吞途径（主要是微胞饮作用和小窝蛋白介导的内吞作用）定位于AL，逐渐发展为MLB，最后以残基的形式排入LV。
图 7 质子驱动的NDHi组装增强基因沉默效率
最后，研究者们将他们开发的纳米装置与目标应用结合起来。内吞途径是细胞摄取纳米药物的一种典型机制。溶酶体中的酸性环境和丰富的水解酶能改变核酸药物的结构，从而影响其治疗效果。此前的研究报道，在脂质纳米颗粒（LNPs）为基础的递送系统中，只有1%~2%的内化siRNA能够逃脱溶酶体的降解。之前几幅图的结果表明，质子驱动的组装能够减弱溶酶体中水解酶的降解能力，因此，溶酶体干扰有望能够提高核酸药物的递送效率。为了研究siRNA在溶酶体干扰系统中的基因沉默效果，研究者们将特异性下调β-肌动蛋白表达的siActin整合至NDs中。为了实现siRNA在NDs上的高效装载，研究者们在siRNA的正义链上设计了一个悬臂DNA序列，其能够与HA发夹结构的3 '伸出部分相连接，而为了实现siRNA的有效释放，HA的3’伸出部分又被设计为一种ATP响应性适配体（ACCTGGGG GAGTATTGCGGAGGAAGGT）。作为HA的对照，HnA可以与siRNA相连接，但其伸出部分为加扰序列（ATTTGACA AATTAAAGCGGAGGAAGGT），在ATP的作用下不能释放siRNA。理论上，带有半i-motif的NDHi-siActin通过内吞途径到达溶酶体，并组装成聚集体；溶酶体酸性的降低将导致水解酶活性减弱，并引起溶酶体功能障碍，这一阶段的溶酶体被称为干涉溶酶体（iLysosome），该酶体能有效地保护siRNA不被核酸酶降解，并提高其胞质的递送效率；然后，HA-siActin在癌细胞高浓度ATP（~5 mM）的条件下释放siActin，以沉默β-actin的表达（图7A）。
为探讨溶酶体干扰对siActin基因沉默效率的影响，研究者们将A549细胞分为6组处理6 h：①PBS（空白组），②NDHi-siScram（阴性对照组），③Lipo-siActin（阳性对照组），④NDHni-siActin，⑤NDHni-siActin+CQ预处理细胞，和⑥NDHi-siActin；不同组的siActin浓度统一为200 nM。CQ可以提高溶酶体pH值，使其中的水解酶失活，作用类似于研究者所开发的质子驱动DNA纳米骨架组装引起的溶酶体干扰，因此CQ和缺乏聚集作用的NDHni-siActin的联合用药相当于是模拟了NDHi-siActin的最终效果。结果显示，在NDHi-siScram组中β-actin的荧光强度与PBS组相当，在其它siActin处理方式的组中观察到更弱的荧光信号，特别是NDHi-siActin处理的细胞中β-actin的荧光强度弱于NDHni-siActin，且与NDHni-siActin和CQ联合给药时的水平相当（图7B & C）。这些结果表明，质子驱动的DNA纳米框架组装有助于通过溶酶体干扰提高基因沉默效率。
研究结论
综上所述，该研究团队开发了一种基于DNA纳米骨架与酸响应半嵌入基序（i-motif）的细胞内组装策略，从而实现溶酶体干扰。研究者们通过HCR将大量的半嵌入基序整合至DNA纳米骨架中，并实现了溶酶体中微米级聚集物的形成。同时，随着嵌入基序的质子化效应耗尽H+，溶酶体内部酸性减弱，水解酶活性降低，内化物质蓄积。因此，整合于DNA纳米框架中的核酸药物免受被干扰的溶酶体中的核酸酶降解，更为有效地递送至细胞质中。本研究揭示了pH响应性纳米材料对亚细胞功能和细胞行为的影响机制，提升了核酸药物基因沉默的效率，并有望在新一代纳米药物的设计中发挥重要作用。
