NUCLEIC ACIDS RES丨miR-CLIP揭示miR-124的iso-MIR（miRNA亚型）的选择性调节

今天分享的文献是21年发表在nucleic acid research上的MiR-CLIP reveals iso-miR selective regulation in the miR-124 targetome.

作者介绍：

通讯作者 Jonathan Hall是苏黎世联邦理工学院药物化学正教授。其研究方向是RNA与疾病相关，包括：Muscleblind (MBNL1) 在 miRNA 生物发生中的作用及其对强直性营养不良和心功能不全的影响；铁螯合酶基因的剪接校正治疗红细胞生成性原卟啉症（EPP）；非典型miRNA——mRNA调控机制。

研究背景：

MiRNAs(又称MicroRNAs或miRs)是一种长度为19 - 25个核苷酸的内源性非编码短RNA，其在进化上高度保守，转录后水平发挥对基因负调控功能。

在经典的mIRNA作用体系中：miRNA 通常具有约 22 个核苷酸，但只有 miRNA 5' 末端的第二至第七或第八个核苷酸负责识别具有互补位点的 mRNA 靶标，因此称为seed region。根据 miRNA 与其 mRNA 靶标的序列互补程度其作用不同：当 miRNA 和 mRNA 碱基配对完全互补时，mRNA 可以被定点切割（在植物中常见），在（动物体内的）大多数情况下，当 mRNA 发生翻译抑制和/或增强 mRNA 降解时碱基对部分与 miRNA。但之后的研究中，发现了很多不同的作用模型：此时seed region可以不完全互补，通过3’miRNA的互补进行介导（揭示了3’miRNA在序列识别时的作用）。在非规范的目标结合中：seed region互补的程度与扩展的3′配对的程度呈现负相关。

新一代高通量测序技术(NGS)的兴起，使得一些新的microRNAs与已知的序列一起被检测出来。起初，这些新分子被解释为测序错误。后来被证明，在小RNA测序数据中观察到的非模板核苷酸添加的百分比(%NTA)明显高于使用计算的预期测序错误率。分析算法的发展支持了这一说法，证实了典型的microRNA序列修改不是人工实验错误产物，而是体内发生的生理事件。这些以前被认为是测序错误现在被认为是具有体内功能和进化重要性的非规范变体，即 miRNA 亚型 (isoMIRs)。

单个 miRNA 基因座会产生多种亚型，这些亚型显示出长度和/或序列组成的差异。根据异质性的方面和区域，与 miRNA 数据库中定义的规范形式相比，根据最近的出版物，isoMIR 可以分为四类：（1）在 5' 端发生变化的 isoMIR，（2）在 3' 端发生变化的 isoMIR； (3) 多态性isoMIRs，序列发生变化； (4) 混合型 isoMIR，序列在 5' 端和/或 3' 端发生变化且序列发生变化。IsoMIR 的生成机制目前还没有完全弄清，简单来说，它可以简化为五个不同的方面：(1)Drosha/Dicer非典型切割，pri-mirna中扭曲和灵活性的下茎会使得Drosha酶的切割位点发生改变，pre-mirna中不同长度和凸起的会使得Dicer酶的切割点发生变化；(2)核酸外切酶的修剪作用；(3)在转录后核苷酸转移酶催化的核苷酸添加; (4)转录时或转录后水平的RNA编辑; (5) miRNAs中的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)（其密度低于基因组中其他部分，特别是在seed region部分）。在功能上microRNA亚型也可以结合Argonaute (Ago)蛋白并可以抑制特异性靶点的表达，但isoMIR 的结构和序列的变化会导致其功能的变化。在分布上：soMIR的分布是具有一定的组织特异性。

科学问题：虽然最初的少数miRNA靶点序列是通过经典遗传学方法发现的，但后来对miRNA靶点识别主要来自生物信息学分析，通过miRNA5’seed region靶点配对模式进行预测（错误率），这些靶点很多都没有通过生物学的方法进行验证。如何更真实地去识别所有isoMIR的靶点？

实验方法：基于该课题组与2014年发表在 nature chemical biology上的一种MIR——CHIP方法进行改进。在pre-miRNA上修饰了生物素（用于纯化）和补骨脂素，转进细胞内，

先通过254nm UV照射下（RNA 中的核苷酸和蛋白质中的氨基酸会产生光化学反应，转变为活性状态，进而形成分子间共价交联），再进行365nm UV照射（在长波长紫外光（365nm）的激发下，补骨脂素能够嵌入富含胸腺嘧啶或者尿嘧啶的双链区域，并与胸腺嘧啶或者尿嘧啶发生共价交联，可以用于双链DNA，双链RNA或者DNA-RNA杂合链的鉴定与分离），在细胞内进行DICER的切割和miRISC的组装，使用AGO2的抗体捕获miRNA-mRNA的复合体，通过链霉亲和素进行富集和纯化，通过蛋白酶K把蛋白质消化掉收集RNA成分，最后送去高通量测序——进行序列分析、比对。

实验结果：

探针设计：为每个3p miRNA合成了两个miR-CLIP探针，miR-132中：两种设计的探针的补骨脂素都修饰在了seed region区域。（hp-132-1;hp-132-2），miR-124在DICER处理后具有两种isoMIR形式，因此，将一种设计的补骨脂素放在了seed region（124-3），另一种放在了3’末端（124-1）（用于捕获mRNA上没有结合的尿嘧啶）。

测试测试探针设计的可行性：使用的不表达这两种miRNA的细胞系：HEK293T细胞，为了确保pre-miRNA探针能够进入miRISC通路并被加工为原生pre-miRNA，对细胞转染了3‘UTR带有miRNA靶点的表达Renilla荧光素酶mRNA（作为报告信号） 也表达萤火虫荧光素酶（fireflyluciferase）的（作为内参）质粒。同时分别转染了不同浓度的pre-miRNA或miR-CLIP（0，2.5nM，10nM，40nM）。通过荧光信号进行分析：可以看到随着miRNA水平的升高，荧光信号出现了明显的下降，说明了pre—miRNA和miRNA探针确实抑制了mRNA的生成。虽然miR-CLIP探针的抑制作用比野生型pre-mirnas低约1.5- 2倍，但报告基因抑制证实了探针可以成功进行剪切并装载在RISC上发挥功能。还检测了6个文献报道的靶点 (miR-124-3p: SP1，PTBP1，ROCK2，EZH2，VAMP3和CTDSP1; miR-132-3p:PTEN，RB1，SIRT1，NAB1，MECP2和 EP300)，发现野生型pre-miR-124、hp-124-1和hp-124-3表现出相似的效果，都不同程度地抑制除ROCK2和EZH2外的所有靶点。Pre-miR-132和hp-132-2的靶抑制水平相似；但hp-132-1在靶点上几乎没有活性，因此没有进一步研究。结果证实，探针可以作为RISC的一部分来抑制其自然靶标。

使用探针进行实验：用低浓度的miR-CLIP探针转染HEK293T细胞，然后在254和365 nm处短暂照射。裂解细胞，用抗ago2抗体IP收集miRISC复合物。然后降解蛋白质，并在链霉亲和素珠上分离RNA复合物，最后进行测序。利用上述每个miRNA的6个靶标进行对照实验，以确保测序前文库的质量，从hp-124-1、hp-124-3和hp-132-2处理的细胞中分离出等量的RNA，并使用qPCR对mrna进行定量分析。作为预期，观察到这些靶点在miR-CLIP样本中发现了最高水平的富集。

对收集的RNA进行测序：对hp-124-1处理后的2个文库、4个hp-1243文库和3个hp-132-2文库进行测序，共测序了1190 - 4090万条reads，映射率从52.6%到90.1%，33.1%到60.6%分配给转录本，序列分析显示，三种探针的miR-CLIP文库中绝大多数reads都是蛋白质编码转录本，使用miR-122序列作为阴性对照。在整个转录本和3 ' utr中搜索miR-132和miR-124 k-mers (6mer, 7mer, 8mer)的靶区，以寻找靶点。将miRNA“目标组”定义为与相应的输入样本相比，miR-CLIP样本中富集最多的1000个转录本。

对作用位点进行分析：据报道，最强和最具抑制作用的miRNA - mrna相互作用是8mer位点(miRNA 2-8nt互补，且1-nt为A)，然后是7mer-M8 (7m8; 2-8nt互补)和7mer-A1位点(2-7nt互补，且1-nt为A)，其次是6mer碱基配对相互作用较弱的（2-7nt互补或3-8nt互补）。miR-124和miR-132以U开始，因此这些miRNA与其7merA1或8mer靶点之间的seed region从miRNA的第一个核苷酸开始。在实验中证实了这一点。

对靶标进行分析： 根据文献，hsa-miR-124产生两种主要的miRNA亚型:miR-124-3p.1(mir - 124)和miR124-3p.2(iso-miR-124)，而hsa-miR-132仅产生一种3p miRNA。为了间接验证miR-CLIP实验数据，采用了两种方法：首先，评估了TargetScan在预测的选定的-靶点集在实验数据中的富集情况。发现miR-132(443个靶点)，miR-124(1738个靶点)和iso-miR-124(1271个靶点)在的mir -clip样本中，其富集程度明显高于其他。第二种工具miRTarBase预测的miRNA靶标也得到了类似的结构。此外，在测量细胞对外源传递的miRNA模拟物的转录组反应后，可以比较预测的miRNA的target和实验捕获的(miR-CLIP)的target。用野生型pre-miR-124或premiR-132处理细胞，并对分离的RNA进行测序。miR-132中TargetSCAN预测出要抑制的转录本包括221种，实际被抑制的157种，且与预测位点相比，这些mRNA（实验发现的位点）被抑制的程度更大。RT-qPCR分析了pre-miR-132转染对前10个mir - clip捕获靶点的影响。10个目标中有9个被抑制;其中7个是预测中有的。miR-124也有类似的发现：两种isoMIR都是类似的发现。

对特殊靶点的分析：Hp-132-2探针捕获的靶点中包括鸟嘌呤核脱附蛋白样3-样蛋白(GNL3L, F4)的mRNA，这是一种核仁GTPase，其耗尽与细胞周期中G2/M阻滞相关。

TargetScan预测脊椎动物GNL3L存在上大量保守性较差的目标位点，所以GNL3L通常不会被认为是miR-132的高置信度靶点。但是miR-132对GNL3L的结合和调控在两个细胞实验得到了证实：pre-miR-132被转染到HEK293T细胞中，通过qPCR检测GNL3L mRNA，在24和48 h后显示出抑制，并通过双荧光酶法验证确实通过miRNA抑制产生的。研究人员在其3'UTR中确定了一个与miR-132具有异常高互补性的假定靶点，在体外也证实其识别。

对iso亚型靶点的分析：hsa-miR-124-1产生两个主要的3p miRNA，它们在5‘端不同。

对预转染miR-124的HEK293T细胞的测序结果分析表明，iso-miR-124比miR-124普遍3.4倍。与人类视网膜细胞的数据不同其中miR-124是主要的亚型，这进一步证明了isomiRs具有细胞特异性。其中iso-miR-124比miR-124对含有7m8靶标基序转录本产生了更大的抑制。为了深入探究miRNA功能的不同，使用miR-124和iso-miR-124的双链体转染了HEK293T细胞，两种不同的iso在16个已被证实的mRNAs靶点都具有一定的抑制作用。对于12/16 mRNAs，miR-124比iso-miR-124更活跃；对于三种mRNAs（SYPL1、ATP6V0E1、RAVER1），miRNA亚型是差不多的，对于一种（LMNB1），iso-miR-124更为活跃。有趣的是，直接转染pre-miR-124对16个mRNAs的抑制程度远远大于单独使用两中IsoMIR。这种效应可能是由于pre-miR-124两种IsomiR具有协同抑制靶点作用。蛋白质水平的抑制与mRNA水平的抑制模式相似。

对iso靶向作用机制不同的研究：研究发现miR-124的许多靶点，都在mRNA中seed region的互补位置5-6核苷酸对面具有鸟苷核苷酸凸起。在5和6位置之间凸起的鸟苷可能通过与AGO2的相互作用而稳定下来。而移位的isomir -124的seed region将无法实现这个结构， 因此，测试了HEK293T细胞中miR-124和iso-miR-124对9个具有这种结构的报告基因的抑制作用。miR-124抑制了所有9个g -凸起位点的表达，但iso-miR124完全没有。最后，研究了miR124亚型对内源性蛋白的这种选择性抑制。我们用两种亚型转染HEK293。miR-124显著降低了DNMT1、LAMTOR1和ZNF280B的表达水平，分别降低了31%、38%和36%；但是它们没有被isomiR-124抑制。总的来说，这些数据与我们的结构假设是一致的，即isomiR无法采用正确的构象来接触目标位点。

讨论部分：对于miRNA亚型来说，5' 端的变化会导致种子区域移位，从而导致功能损失或增益，而3'端的修饰也可能影响其特异性。

总结：本研究通过应用miR-CLIP探索了不同miRNA亚型的靶点及作用强度的异同，利用结构数据提出了模型解释不同亚型作用的区别。阐释了miRNA和Argonautes蛋白如何共同工作，产生非规范的相互作用，从而实现了isoMIR的特异性靶向。