NAT CHEM丨通过可编程DNA链置换技术实现的动态蛋白质组装

通过DNA链置换对荧光蛋白的动态组装。

为了证明动态蛋白的可行性，使用荧光蛋白对，青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)作为模型蛋白。利用众所周知的CFP-YFP对已知的荧光共振能量转移(FRET)特性，可以很容易地实时监测这两种蛋白质的组装和分解。单输入蛋白质-DNA装置的基本设计如图1a所示。为了将CFP和YFP连接到DNA链上，使用CFP和YFP与HaloTag蛋白融合来提供DNA链的位点特异性装饰(图1b)。每个融合蛋白都被设计为在c端包含CFP或YFP，在n端包含一个弹性蛋白样多肽(ELP)标签，用于简化纯化。利用HaloTag的配体识别特性，将一条氯己烷修饰的DNA链共价连接到每个融合蛋白上。在用氯己化学化的DNA链标记之前，使用两个循环的热触发沉淀和溶解来纯化这两种融合蛋白。所得到的蛋白质-DNA结合物通过一个额外的ELP热循环再次纯化，以去除任何多余的DNA。对于这两种蛋白，标记反应都非常有效(标记效率为95%)。当两个预杂交复合物混合在一起时，即使孵育45 min，FRET也没有显著增加，因为所有的toeholds都被隔离(图1c)。 然而，在加入输入链F后，YFP偶轭物上的隔离链E迅速置换。释放的YFP-D偶联物包含一个暴露的单链DNA趾点结构域(d)，它能够与C链上的趾点(d*)杂交，并触发B链的位移。这导致CFP-A和YFP-D共同组装到单个支架链C上，这反映在30 min内FRET的快速增加 (图1c)。即使是一条RNA输入链也能引起类似的FRET反应(图1c)

图 1. 基于链置换的蛋白质-DNA 装置。

动态FRET控制使用多输入、可逆和放大的体系结构。

接下来，研究了动态蛋白质组装是否可以由一个更复杂的双输入和门设计来驱动。这个新的电路包括一个额外的CFP-a结合物的隔离链H和一个阻断链G，这样的支架C链最初不装载任何蛋白质（图2a）。两种荧光蛋白的组装只有在存在两种不同输入F和i的情况下才被触发。在单输入电路的情况下，在没有输入的情况下，背景信号是最小的(图2b)。相比之下，在添加两种输入后，FRET显著增加，在40 min内达到饱和(图2b)。双输入电路在动力学上比单输入设计慢，因为在FRET发生之前需要四个不同的链置换反应，而不是两个。

为了尽量减少这种竞争，对OFF和基于toehold交换的概念，作者缩短了结构域(c)(cp*或cp)的OFF和ON链的3‘端，使ON链(cp-d-e-g)不再与支架链上的YFP-D结合位点完全互补 C. 然而，OFF链仍然可以取代YFP-D共轭物，使入侵点(e/e*)延长两个碱基对(c/cp*)区域(图2c)。这种简单的改变导致了提供几个开关蛋白组装的能力，如FRET信号的变化(图2d)。每个周期的FRET反应略有下降，主要是由于未杂交的ON链的积累，在与 toehold链结合时可以与YFP-D竞争 C.

图 2. 多输入和可逆设备结构。

   toehold介导的链置换电路最有用的特征之一是能够放大非常小的生物信号，这一特征对于RNA驱动的细胞内回路至关重要，因为即使在疾病细胞中，典型的miRNA浓度高表达，其浓度也相对较低。催化发夹组件(CHA)，其中使用两个动力学捕获的发夹（H1和H2）以自催化和级联方式放大电路响应（图3a）用于信号放大。理想情况下，将荧光蛋白直接标记到H1和H2上将是蛋白质组装的完美选择，因为杂交后它们会彼此相邻(图3a)。然而，高温退火条件对于防止不完全的发夹形成和系统泄漏至关重要，从而排除了蛋白质直接结合到发夹上。在没有催化剂链的情况下，没有检测到FRET，但在加入miR-122后，观察到FRET急剧增加(图3b)。

图 3. 信号放大蛋白-DNA 装置。

DNA链置换对酶级联反应的动态驱动。

大自然已经进化出了一种有趣的策略，通过诱导对酶组织的邻近控制来调节复杂的代谢反应。纤维素体是一种自然发生的酶复合物，提供高度协同水解纤维素。作者提出了一个问题，即是否可以仅仅通过控制内切葡聚糖酶CelA和纤维素结合模块(CBM)的组装来调节纤维素水解的速率(图4a)。为了组装CelA和CBM，首先构建了类似的ELP-HaloTag融合体。在连接适当的DNA链以创建CelA-A和CBM-D偶联物后，这两个蛋白被组织到支架链C上。与游离蛋白混合物相比，使用组装结构在还原糖产量方面提高了1.5倍(图4c)。D链上的侧翼趾点结构域(e)允许CBM-D共轭物很容易被添加一个不包含(e*)的链所取代。通过添加NOT链破坏纤维素酶结构，导致在天然PAGE上形成快速迁移的CelA-a：C和CBM-D：NOT复合物带，并相应的纤维素水解效率降低(图4c)。

图 4. 动态人造纤维素体。

用于前药激活的DNA逻辑装置

蛋白质-DNA逻辑设备最有趣的用途是执行多输入计算的能力。通过利用生物分子作为输入和生物活性反应作为输出，生物分子计算设备可以被生产出来，用于生物过程的“逻辑”控制。这种类型的合成计算设备非常适合于感知多种癌症特异性生物标记物，以创建“智能药物”，检测疾病状态，并驱动适当的细胞杀伤治疗反应。酵母胞嘧啶脱氨酶(yCD)具有将5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨成5-氟尿嘧啶(5-FU)的能力，这是一种可用于抑制DNA合成的化疗药物。最近发现的分裂yCD片段(称为F1和F2)在侧翼相互作用域的存在下有条件地重组，这为一种基于toehold介导的链置换诱导分裂yCD组装的前药激活新机制提供了框架。

仅在miR-21和miR-122同时存在的情况下，才检测到完全yCD激活的双输入电路，观察到类似的反应。仅添加一个输入就可以检测到少量的生长抑制(图5b)，这与CFP-YFP实验的低水平泄漏相一致。最后，我们试图证明，放大电路的设计也可以类似地用于yCD的激活和生长抑制(图5c)。与单输入电路(图5a)相比，由于CHA发夹的泄漏最小，其对背景生长的抑制作用略多。然而，扩增是明显的，因为即使是0.1×的miR-122(90nM)也足以引起显著的生长抑制（与没有输入时相比，生长下降了34%）。考虑到将5-FC加入CHA反应2h后，抑制程度小于最大值，远在扩增完成之前，扩增水平更令人印象深刻。这样做是为了更好地区分放大水平的差异。对于前药激活，即使在处理低miRNA浓度时，扩增也对最大限度地提高细胞死亡特别有用。

图 5. miRNA 输入引导的前药激活装置。

虽然分裂yCD结果是在体外进行的，但最近的研究表明，在活的哺乳动物细胞中成功地执行了链置换电路，这表明，该方法控制分裂yCD重建是在细胞内高度可实现的。

总结

在本研究中，引入了一种新的基于toehold链置换驱动的DNA逻辑电路的动态蛋白质组装框架。电路设计的模块化使得构建广泛的输入引导DNA逻辑器件，作为动态蛋白质组装的强大信息载体。证明了蛋白质接近控制不仅用于调节酶活性，而且可能最适合于创建布尔逻辑计算、传感和响应设备可放大和可编程的前药激活。由于链置换反应依赖于序列，因此可以将不同的动态复合物设计为正交操作，并集成到可编程反应网络中，对疾病细胞中异常表达的内源性生物输入进行复杂的计算。这种敏感性进一步表明了该设计对基于细胞的应用程序的潜在用途。展望未来，这项技术的最终实现是在活细胞内执行这样一个可编程设备。这种“细胞分类器”的发展将为智能诊断和治疗开辟一个新的可能性领域。