SCIENCE | 蛋白马达通过在DNA纳米管定向移动实现可编程的分子运输
大家好，今天分享的是2022年3月发表在《SCIENCE》上的一篇文献: Programmable molecular transport achieved by engineering protein motors to move on DNA nanotubes，这篇文献的通讯作者是日本国立信息通信技术研究院的Ken’ya Furuta教授。这篇文献开发了一种可以在DNA纳米管轨道上移动的蛋白马达，其在DNA纳米管上的移动速度比相应的DNA walkers快>100倍，并且DNA纳米管轨道可被这些蛋白马达重复使用。
活细胞内生物分子马达（如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白）沿着特定的细胞骨架轨道移动，以在真核细胞内进行材料的分类、驱动和组装。这些基于蛋白质的马达在细胞中表现出自主的远程运输，然而轨道设计和控制的不灵活性阻碍了其实际应用。相比细胞骨架轨道，DNA轨道更稳定，可以精确设计成所需的三维结构，并在单碱基水平上进行控制。使用DNA轨道的一种选择是使用“DNA walker”作为马达。目前已开发出多种DNA walker，可在DNA轨道上定向或扩散移动。但这些DNA walker运行非常缓慢或其DNA轨道只能使用一次。
本研究开发了基于蛋白质的马达，其在DNA轨道上的移动速度比相应的DNA walker快100倍，且其DNA轨道可重复使用。作者使用蛋白质工程方法来创建可在DNA纳米结构上移动的杂合马达。选择动力蛋白作为引擎，动力蛋白包括ATP的水解模块和与轨道的结合模块。将细胞质动力蛋白的原始轨道结合域替换成DNA结合域（图1A）。与轨道的定向绑定是创建沿轨道单向移动的马达的关键，因此选择识别非回文DNA序列的DNA结合蛋白。为了评估系统的运动性质，作者首先进行了传统的滑动试验，其中马达固定在玻璃表面上，DNA纳米管在其上滑动。19种DNA结合结构域中的11种被确定以序列特异性方式介导DNA纳米管轨道的定向运动（图1B-D）。DNA纳米管的平均速度高度依赖于杂合马达的类型，速度范围从5.3到220 nm/s（图1E)。杂合马达的ATP酶缺陷突变体不会驱动滑行，表明动力蛋白运动结构域的ATP水解对于DNA纳米管运动必不可少。此外，没有发现DNA纳米管滑动速度和ATPase速率之间存在线性关系（图1E-F），表明其他因素如结合动力学定义了滑行速度。
图1 杂合马达的DNA纳米管滑动实验及ATPase测定
作者制备了两种类型的DNA纳米管来作为马达轨道，包括单链形式（SST）以及双链交叉形式（DX）的纳米管（图 2）。SST管具有控制纳米管刚性的优势，而DX管可控制马达结合位点的数量。所有类型的DNA纳米管均可在杂合马达表面定向移动（图2A-C）。与每个横截面只有一个结合位点的SST管不同，DX管具有多个结合位点（图2D）。与SST管相比，每节包含三个结合位点的DX管的移动速度快了四倍（图2E-F）。DX管上更多的结合位点有助于马达更快地识别结合位点。然而当结合位点数量增加到六个时速度减慢了大约两倍。因此，在随后的实验中主要使用每节包含三个结合位点的DX管。杂合马达的传输方向可以通过简单而通用的方式进行编程，即仅翻转DNA纳米管中识别序列的方向。用ATTO 647染料标记在DNA纳米管的一端，结果表明马达的方向性由轨道上DNA结合域的方向决定，从而控制分子运输的方向（图2G-L）。
图2 DNA纳米管结构的影响和方向性的控制
然后，作者研究了杂合马达LEF1-Dyn是否可以在DNA纳米管轨道上运输货物。在细胞中，当没有货物时，细胞质动力蛋白通过运动结构域的自我二聚化而被自身抑制。因此，作者构建了一个人工二聚体，通过α-肌动蛋白的刚性杆结构域将运动结构域分开，从而将运动结构域从自身抑制中释放出来。尽管生成的单个人工二聚体在DNA纳米管上表现出定向运动，但该运动包含扩散成分，并且不具有高度的持续性（平均约为700 nm），这对于微米级系统来说是不够的（图3A-D)。为了增加运行长度，作者使用具有15个马达结合位点的DNA折纸支架作为模板构建了杂合马达组（图3E）。当杂合马达连接在一起时，运动距离变得更长（图3F-G）。
图3 DNA纳米管轨道上的单分子和多分子运动性测定
DNA轨道上分子的分类和整合等功能需要一个连接不同DNA轨道的连接点。作者通过构建Y形DNA纳米管轨道来实现，图4A构建了一个“分散器”和一个“聚合器”。在分散器中，放置LEF1识别序列，使LEF1-Dyn从Y形轨道的中心移动到外围。在聚合器中，方向设置为相反。图4B-C显示荧光标记的货物成功地分散或聚集。接下来，作者使用两种不同的转运蛋白来实现更精细的系统，每一种转运蛋白都可以识别单个轨道上的不同DNA序列，而不会产生串扰。作者选择了LEF-Dyn和σE4-Dyn的组合，因为它们几乎没有串扰并且处于相同的速度范围内。然而，为了与LEF-Dyn同时工作，σE4-Dyn的单个DNA折纸货物上的马达数量增加到33。
为了构建一个“分类器”和一个“集成器”系统（图4D），作者设计了新的Y形接头：（i）包含LEF1识别序列的纳米管（称为“LEF1轨道”），（ii）包含σE4识别序列的纳米管（“σE4轨道”）和（iii）同时包含LEF1和σE4识别序列的纳米管（“LEF1+σE4 轨道”）。分类器设计为分支的Y形轨道，其中LEF1和σE4轨道从LEF1+σE4轨道分支（图4E）。然后，将σE4-Dyn和LEF1-Dyn货物复合物同时引入流通池，以观察Y形轨道上的运输。在分类器中，LEF1-Dyn或σE4-Dyn马达携带的DNA折纸货物分别被分拣到LEF1或σE4轨道。分类器具有高特异性，货物分拣错误率仅为3.0±0.3%。串扰仅在两种不同的DNA折纸货物彼此非特异性结合时才会发生。集成器与分类器相反，LEF1和σE4轨道在连接点汇合为LEF1+σE4轨道。集成器成功将两种类型的货物集成到一个轨道中（图4G)。除了集成器中的σE4-Dyn-origami复合物（图4H-I）外，在路口停止或脱离轨道的货物百分比<20%。
图4 Y形DNA纳米管轨道上的分子运输系统
全文总结：
该工作使用基于蛋白质的杂合马达和DNA轨道，构建了一种可快速移动、可重复使用以及构筑灵活的分子马达与轨道系统。蛋白质马达在DNA轨道上运行速度可达220 nm/s，虽然与细胞内分子马达相比仍属于低速，但应该足以在细胞中执行各种任务。此外，该系统的DNA轨道结构可被灵活设计，以满足不同高度可控的运输和驱动系统的需求。
Ibusuki et al., Science 375, 1159–1164 (2022)
