NAT COMMUN丨CRISPR介导的非重复基因组位点的多重活细胞成像
大家好，今天分享的是发表在Nature Communications上题为“CRISPR-mediated multiplexed live cell imaging of nonrepetitive genomic loci with one guide RNA per locus”的文献，通讯作者为亚利桑那州立大学生物与卫生系统工程学院的Albert W. Cheng教授。
在此之前Albert W. Cheng教授课题组就提出了名为“Casilio”的模块化多任务处理CRISPR/Cas平台（Cell Research 2016, 26, 254-257）。图1展示了Casilio的基本原理和应用示例，PUF蛋白是一种RNA结合蛋白，PUF结构域包含肽亚基，通过编程每个肽亚基与RNA接触的氨基酸以识别不同的RNA碱基，每个PUF结构域能够识别8 mer的PUF结合序列（PBS）。在PUF上融合不同的效应器，可以创建不同的Casilio模块，每个模块具有独立的功能。而gRNA含有一个或多个PBS，用于拴系效应器的PUF结合，因此，效应器可以被招募到dCas9/gRNA-PBS复合物上。Casilio利用PUF结构域的多功能性，允许同时、正交地将效应器功能传递到不同基因座，以实现多任务处理。Casilio系统能够克服传统基于CRISPR的成像方法无法对非重复序列高效成像的局限性，使用一个gRNA即可实现非重复序列的成像。此外，作者还构建了Casilio双色探针，以可视化单个活细胞中DNA元件在存在或不存在黏连蛋白亚基RAD21下的动态相互作用，以及使用三色调色沿着染色质跟踪多个位点的3D动态位置。
图1 Casilio系统示意图
利用单个gRNA标记的Casilio系统对非重复基因座成像
多聚化的Casilio平台为非重复序列的成像提供了良好的途径。为了探究基于单个gRNA的Casilio系统对活细胞非重复序列成像的特异性，选取MUC4作为靶向基因，由于MUC4基因不仅含有非重复序列，还含有重复序列，因此能够使用DNA-FISH共标记进行验证。如图2所示，设计的gMUC4靶向MUC4内的非重复序列，并插入15个拷贝的PUF结合位点，以招募荧光标签Clover-PUFc，分别对U2OS和ARPE-19细胞内的MUC4基因成像。为了验证Casilio系统的特异性，利用Cy5-MUC4 DNA FISH荧光探针对MUC4基因进行标记，绿色和红色荧光斑点的高度共定位（图2b-c）表明Casilio系统仅使用单个gRNA即可实现非重复基因座的高特异性标记。在U2OS和ARPE-19细胞中的特异性分别为96%和100%，其中，dCas9的存在为高特异性提供了额外支持（图2d）。此外，荧光斑点的数量与二倍体ARPE-19和单倍体HAP1的倍性一致，ARPE-19的斑点形成效率约为68%，HAP1的斑点形成效率约为54%（图2d-e）。以上结果表明Casilio系统只需要一个gRNA即可实现非重复DNA序列的特异性标记。
图2 Casilio成像特异性验证
用双色标记跟踪染色质相互作用
接下来，作者探究了Casilio平台在是否能够跟踪染色质的相互作用。已经证实在ARPE-19细胞中，MASP1-BCL6 loop中相互作用锚之间的基因组距离为362 kb。如图3a所示，作者设计了一对gRNA分别结合两个锚点旁边的非重复序列，使用Clover-PUFc标记5'锚（基因座A），PUF9R-iRFP670标记3'锚（基因座B），双色Casiolio探针对转染的ARPE-19活细胞成像显示了第二时间尺度上的动态染色质相互作用，并显示出高度的细胞间异质性和等位基因间异步性（图3b-c），这些信息无法通过批量细胞测序技术轻易获得，展示了Casilio活细胞成像在研究单细胞和单等位基因水平上的染色质相互作用动力学方面的优势。
为了确定双色标记的特异性，利用“竞争”法进行验证。特异性竞争者gRNA没有任何用于招募荧光蛋白的PUF结合位点，但与目标基因A杂交，被共同引入细胞中，以干扰Casilio成像（图3d）同时，以不与目标基因A杂交的非特异性竞争gRNA（GAL4 27）作为对照。与非特异的cGAL4相比，特异性竞争者gRNA（cA）大大减少了绿色荧光斑点的形成（图3e）。正如预期的那样，在非干扰位置（基因座B）形成的红色斑点不受以上竞争gRNA的影响，证明了双色标记的高特异性。
为了描绘MASP1-BCL6区域周围的染色质结构，作者跟踪了距离基因座B 312 kb的3'额外位置（基因座R，图3f）。图3g-h结果显示A-B对距离（平均1.36 µm，中位数0.97 µm）显著低于B-R对距离（平均1.81 µm，中位数1.40 µm），与ChIA-PET数据一致，证明了A-B之间的相互作用比B-R更广泛。
图3 Casilio活细胞成像验证染色质的相互作用
之前的一项研究对工程化的HCT116细胞进行了Hi-C测定，并证明了该细胞内源性黏连蛋白RAD21的消耗会导致包括IER5L启动子（IER5L-P）与其超级增强子（IER5L-SE）之间约500 kb的环域丢失。为了验证Casilio是否可以用于研究黏连蛋白复合物在染色质相互作用中的功能，作者利用工程化的HCT116细胞系，其中内源性RAD21与生长素诱导的降解决定子融合，可通过加入生长素耗尽RAD21。对未用生长素处理（−Auxin）和生长素处理（+Auxin，导致RAD21耗尽）的细胞进行活细胞成像（图4b-c）。与未处理的对照相比，用生长素处理导致RAD21消耗的细胞中Casilio斑点对的距离更远，中位数分别为1.21 µm和2.09 µm（图 4d），这一结果与IER5L启动子和其超级增强子之间的相互作用在RAD21耗尽后减少是一致的。
作者还使用Casilio对连接两个富含H3K27ac的超级增强子“不依赖RAD21”的相互作用进行成像，结果相反，相互作用频率在RAD21耗尽时增加（图4e）。与通过Hi-C测序实验获得的结果一致，在生长素引起RAD21耗尽时Casilio斑点对的距离减小，对于未处理和生长素处理的细胞，中位数分别为1.24 µm和0.57 µm（图4f-h）。
图4 RAD21存在和不存在时RAD21依赖和独立相互作用的Casilio可视化
使用三色调色板可视化折叠动力学
对于增强子和启动子等非编码元件的特定相互作用进行成像为基因调控提供了新的理解，同时，基因片段持续伸缩的可视化能够提高对结构折叠动力学的理解，并阐明染色质环的形成过程。由于Casilio可以用单个gRNA对非重复基因座进行成像，作者探索了同时成像多个非重复基因的可能性，将连续的Casilio探针依次部署在一段基因组DNA中，最终的目标是能够跟踪连续基因组区域的“活”结构。
为了增加可以标记的非重复基因座的数量，作者使用了三个gRNA（IER5L P-20xPBS48107、M-20xPBSc和SE-25xPBS9R），分别结合一种荧光蛋白（Clover-PUF48107，iRFP670-PUFc和PUF9RmRuby2），开发了一种三色调色板（图5a）。利用Casilio三色调色板在IER5L P-SE loop上分别标记三个非重复序列（图5b-c），实验结果证明了使用双色或三色荧光蛋白组合来编码Casilio探针序列，能够实现沿基因组区域多个位点的可视化。
图5染色质环的三点三色活细胞成像
全文总结：本文报告了一种通用的基于CRISPR/Casilio的成像方法，使用单个gRNA实现了对非重复基因组位点的高效成像；构建了Casilio双色探针，以可视化单个活细胞中黏连蛋白RAD21对DNA元素动态相互作用的影响；使用三色调色，沿着染色质环跟踪多个位点的3D动态位置；Casilio系统具有新效应器功能的多路复用和可扩展性。
Nature Communications 2022, 13, 1871.
