韩 达 课 题 组

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Bioeng Transl Med丨具有适体靶向干细胞募集和生长因子诱导的各向异性半月板再生促分化作用的集成生物活性支架

今天分享的文献是近期在线发表在Bioeng Transl Med.上的一篇文章,标题为“Integrated bioactive scaffold with aptamer-targeted stem cell recruitment and growth factor-induced pro-differentiation effects for anisotropic meniscal regeneration”。

有关作者

     本文的通讯作者为来自南开大学与中国人民解放军总医院的主任医师郭全义,北京大学人民医院的杨震教授,研究方向分别为干细胞和骨关节微创与康复,天然产物的合成。

研究背景:

半月板撕裂是膝关节最常见的损伤,常伴有急性前交叉韧带病变。发生在无血管区域的半月板损伤通常不能愈合,是造成骨关节炎的主要危险因素。

目前的治疗策略主要包括关节镜缝合、部分或全半月板切除术和半月板异体移植。然而,关节镜半月板切除术不可避免地导致进行性软骨退行性变和骨关节炎;植入物已应用于临床,但也有一定局限性,如供体数量不足、植入物缩小和疾病传播的风险。从临床角度来看,复杂的半月板撕裂是无法通过手术修复来实现天然半月板的结构和功能特性的恢复。因此,半月板缺损的重建是骨科医生和生物工程科学家面临的巨大挑战,对相关患者具有重要意义。

近年来,原位半月板组织工程策略指导内源性细胞的募集和增殖,促进其纤维软骨形成分化,引起了极大的关注。目前,该策略的主要挑战是内源性间充质干细胞(MSCs)的非特异性和募集不足和是推动内源性干细胞(ESPCs)作为一个异质群体或单细胞子代进入纤维软骨细胞。一些生长因子和趋化因子,如骨形态蛋白和基质细胞来源的因子,可诱导内皮细胞和炎症细胞的非特异性迁移,这加重炎症反应,阻碍半月板修复。值得注意的是,顺序应用结缔组织生长因子(CTGF)和转化生长因子(TGF-β3)被证明是必要和足以诱导间充质干细胞分化成纤维软骨细胞表型。此外,DNA适配体,Apt19s,被开发出来作为治疗药物来识别和捕获骨髓间充质干细胞,用于组织再生时,与MSCs特异性结合,促进其迁移,随后与促软骨分子结合时促进软骨再生。因此,一种能够选择性招募骨髓间充质干细胞的适配体定向修复系统,将为膝关节半月板原位修复铺平一条很有前途的新途径。

在本研究中,我们构建了一种多孔3D PCL/PDA/GE Apt/具有仿生微结构的GF支架,以两阶段的方式顺序释放Apt19sCTGFTGF-β3。第一阶段,快速释放Apt19s作为一种信号分子,刺激关节内常驻ESPC的动员和招募,以渗透到关节中;第二阶段,依次释放CTGFTGF-β3配合生物力学刺激引导细胞在靶空间分化迁移和增殖,促进纤维软骨细胞分化与半月板原位修复。(图1

1 Apt19s-GF支架设计示意图

 

结果与讨论:

1.功能性半月板支架的制备与表征

2聚己内酯(PCL)PCL/聚多巴胺(PDA)PCL/PDA/GEPCL/PDA/GEblalk聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)支架的理化性质

为了得到与天然半月板力学性能相近的支架,研究人员对制备的支架进行宏观和微观结构观测(图2ab),并采用XPS光谱法对四种已制备的支架的化学成分进行了评价,由于增加PCL支架的表面亲水性有利于细胞粘附和杂交支架的构建,研究人员利用多巴胺在碱性溶液中氧化自聚合形成的PDA表面修饰来改善PCL纤维的生物功能(图2c)。之后进行接触角评价,其他三组均显著低于PCL组,表明亲水性促进细胞附着(2d)。为了在仿生支架的生物打印过程中,得到合理的模型和参数设计,研究人员测定3D打印支架的仿生压缩和拉伸力学性能,与天然弯月板相比力学性能理想之间无显著差异(图2ef)。利用FTIR光谱法对材料的结构变化进行了表征,三个制备样品的FTIR光谱显示出一些显著的差异,证明了混合支架的表面修饰和制造的成功(图2g)。用相应的ELISA试剂盒研究TGF-β3CTGF的体外释放谱,TGF-β3从支架上的总体连续释放比CTGF相对缓慢,结果表明,微球/水凝胶复合给药系统保护了两种gf并依次呈现出的生物活性,提高了支架诱导ESPC分化的能力。(图2h

综上,该支架具有良好的力学性能,可为半月板原位复建提供最佳的平台。

2.功能性半月板支架的生物相容性

3聚己内酯(PCL)PCL/PDAPCL/聚多巴胺(PDA)/GEPCL/PDA/GE-blankPLGA支架的细胞相容性

接着,进一步测定该支架在人体内的生物相容性,研究人员对其进行活/死染色,四组共聚焦显微镜显示所有支架中几乎所有活细胞(绿色)说明每个支架的微环境都有利于细胞生长(3a)。随后,DAPI/F-actin染色观察各组的细胞形态,各组均表现出不同的拉伸特征,PCL/PDA/GE组和PCL/PDA/GE-blankPLGA组在四组中细胞扩散效果最好(3b)。之后通过将归一化后的细胞扩散面积定量进一步评估不同支架的细胞形态,结果显示,与纯PCL支架相比,PDA修饰的PCL支架增强了细胞的拉伸。4组中PCL/PDA/GE支架的细胞面积最大,与图3b的共聚焦图像一致(图3c)。此外,CCK-8检测发现,从第1天到第7天,培养在支架上的SMSCs的数量逐渐增加,并且PCL/PDA支架的细胞增殖率高于PCL支架。PCL/PDA/GE组的生长速度在四组中最高(3d) 

  综上所述,PCL/PDA/GEPCL/PDA/GE-blank PLGA支架具有良好的生物相容性,可为迁移细胞的粘附、增殖和扩散提供最佳的平台。

3.Apt19S促进了MSCs的体内外特异性迁移

4 Apt19s对滑膜来源的间充质干细胞(SMSCs)的特异性结合和招募能力

研究人员验证了该支架的生物相容性后,进一步研究Apt19s促进MSCs在体内外特异性迁移的效果,首先体外验证Apt19s能够特异性识别和结合SMSCs,研究人员将FAM标记的适配体与兔SMSCs、兔MFCs和小鼠巨噬细胞孵育,并用荧光显微镜检测。当fam标记的Apt19SSMSCs孵育时,可以观察到代表Apt19SSMSC表面的绿色荧光明显重叠(4a),此外,对适配体标记细胞的定量分析显示,近40%SMSCs被绿色荧光标记,明显高于其他标记细胞的百分比(4b),证实了体外Apt19S对兔SMSCs的特异性识别和结合能力;接着,研究人员通过调查体外不同浓度的Apt19s SMSC迁移的影响探讨了体外Apt19sSMSCs特异性招募和动员能力,在10nM100nMApt19S组中,迁移的SMSCs数量远远超过1nM Apt19S组且二者之间无显著性差异,说明10nMApt19s可能足以招募SMSCs(图4c-g);此外,他们还探讨了Apt19S是否可以招募其他可能参与修复过程的细胞类型,包括MFC和巨噬细胞。结果表明,在对照组和不同浓度的适配体下,MFCs和巨噬细胞的数量没有显著差异(图7);最后进一步评估了Apt19s偶联水凝胶对体外骨髓间充质干细胞动员的影响。将含有Apt19s的水凝胶放置在Transwell插入物的下面,用结晶紫进行组织学染色,显示迁移的细胞分布均匀。培养24h后,Apt-水凝胶组和Apt/gf-水凝胶组中迁移的SMSCs数量分别为显著高于对照组和水凝胶组,两组间无明显差异。(图5ab)。

综上所述,Apt19s能够特异性识别、结合和捕获SMSCs,当从水凝胶中释放时,能够增强MSC的招募和动员。

5 不同组间间充质干细胞(MSCs)的体内外招募

以上体外实验结果显示Apt19s能够特异性识别和招募SMSCs,但其在体内对MSC的招募能力尚不清楚。因此,通过在大鼠半月板中植入Apt水凝胶并在术后1周收获来评估体内迁移。共聚焦成像显示,Apt-水凝胶组的细胞总数均高于水凝胶组而与Apt/gf-水凝胶组无显著差异,说明Apt19S确实能促进细胞迁移(5cd)。此外,他们选择了CD73CD105SMSCs特异性标记来识别迁移到缺陷的半月板,结果显示,Apt-水凝胶组和Apt/GF水凝胶组中CD73/CD105双阳性细胞的数量显著高于对照组和水凝胶组(5ce)综上,体内实验结果表明Apt19s可以特异性捕获SMSCs,并在再生过程中促进其向半月板缺损部位的迁移。

4.Apt/GF支架获得了对关节软骨更好的防护效果

6 滑膜、apt支架和SMSCs)在支架和apt/=支架中培养714天的体外软骨生成和纤维软骨生成基因表达谱

除了验证该支架具有良好的生物相容性和特异性招募能力外,他们还通过RT-PCR方法研究了半月板软骨基因(COL2ACANSOX9)和纤维软骨基因(COL1TNCFN1)在不同支架中的体外表达。结果显示,随着CTGF-NPsTGF-β3-MPs的掺入,在第7天和第14天察到软骨分化和纤维软骨分化显著增加。说明GF可能在促进半月板相关基因表达中发挥重要作用(6)

综上,CTGFTGF-β3可依次从支架中释放,可以显著刺激SMCSs的纤维软骨和软骨分化。

5.体内半月板修复研究

7 磁共振成像(MRI)和全器官磁共振成像评分评估兔膝关节

(再生的半月板和关节软骨用一个红色的圆圈标记)

  为了进一步研究该支架在体内半月板修复的效果,通过MRI分析比较不同组缺损部位的再生半月板组织。在Apt/GF支架组,术后3个月观察到再生的半月板,并随时间生长,软骨表面也很光滑。(7a)此外,Apt/GF支架组的WORMS评分明显低于支架组和Apt支架组,与假手术组最接近,表明该整合的生物活性支架具有良好的再生效果(7b)

8再生半月板的宏观和生化评价

接着观察膝关节剥离后再生半月板及相应的股骨髁以及胫骨平台的宏观形态,植入3个月后,支架组、Apt支架组、Apt/GF支架组原位形成半月板样组织,Apt/GF支架组再生半月板更加完整均匀,更好地融入关节,且新生神经的大体外观优于其他支架组,与假手术组相似(8a)。此外,在3个月和6个月时,COL-1COL-2和总GAG定量检测半月板的内外区域特别是在Apt/GF支架组,ECM的组织类似于天然半月板(8b-g)

9修复后的股骨髁和胫骨平台半月板和软骨的组织学和免疫组化染色

(红色和双折射纤维代表I型胶原,III型胶原为绿色)

除了观察宏观形态外,研究人员通过对植入物H&E染色、TB染色、SR染色和免疫组化染色,观察其组织学特征。在Apt/GF支架组中,在两个时间点的H&E染色都可以观察到大量细长的成纤维细胞样细胞或圆形软骨细胞样细胞(9ab)TB和内区II型胶原免疫组化染色,外区I型胶原免疫组化染色较强,6个月时染色强度强于3个月时,显示出与假手术组中的天然半月板相似的细胞形态(9cef)。在SR染色中,Apt/GF支架组染色强度强于其他支架组中,在外部和内部区域均观察到更有序和排列紧密的胶原纤维,与原生组相似(9d)

10  藏红花素-o/快速绿色(SOG)染色图像、ICRS评价和Mankin对股骨髁和胫骨平台软骨退变的评分

最后,研究人员评价各种支架对软骨的保护作用,对软骨的大体观察显示,Apt/GF支架组的软骨减少和降解均少于其他组(10a)ICRSMankin评分也显示,Apt/GF支架组的软骨表现最佳(10bc)SOG染色显示空白组和支架组软骨明显退化和开裂,而Apt支架组和Apt/GF支架组很少,且Apt/GF支架组较好,此外,空白组在股骨髁和胫骨平台上出现深裂缝和陷窝。支架组和Apt支架组也表现出表面裂纹和缠绕的纤维表面,而Apt/gf支架组的软骨表面较平坦,几乎没有裂纹。

综上,Apt/GF支架组具有优越的软骨保护能力。

总结:

1.Apt19S促进MSCs在体内外的特异性迁移。

2.Apt/GFs支架可促进半月板再生和纤维软骨分化。

https://doi.org/10.1002/btm2.10302

Hao LiTianyuan ZhaoFuyang CaoHaoyuan DengSonglin He Jianwei LiShuyun LiuZhen YangZhiguo YuanQuanyi Guo . Bioeng Transl Med. 2022;e10302.

2022年5月16日 10:38
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