SCIENCE丨体内CAR-T细胞疗法治疗心肌纤维化

今天分享的是在2022-1发表在Science的封面文章，标题为：CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury.

有关作者：

本文的通讯作者为宾夕法尼亚大学Perelman医学院的Haig Aghajanian、Drew Weissman、Hamideh Parhiz、Jonathan A. Epstein。四位教授的科研方向分别为细胞生物学/发育生物学、RNA疫苗及基因治疗、核酸疗法/纳米工程/纳米药物递送/mRNA疗法、心血管相关医学/发育生物学。

研究背景：

CAR-T细胞计数的应用，目前主要集中在肿瘤治疗领域。该免疫疗法最初是由宾夕法尼亚大学的Carl June教授提出，并于2017年获得FDA批准，在白血病、淋巴瘤等的治疗中做出巨大贡献。传统的CAR-T细胞疗法操作往往十分复杂，需要从患者或捐赠者体内分离出T细胞，并在实验室中进行基因重编程。培养出大量CAR-T细胞后再回输至患者体内发挥作用。这个过程不但复杂，而且价格昂贵。

图1: CAR-T疗法。

而2022年1月6日，宾夕法尼亚大学Perelman医学院研究人员通过向小鼠体内注射mRNA制剂，对心衰小鼠体内的T细胞进行重编程，实现体内CAR-T治疗，成功逆转了小鼠心脏纤维化，恢复心脏功能。

结果与讨论：

由于天然mRNA的稳定性较差，因此作者通过修饰核苷酸、在mRNA链头端加帽（capping）、加长poly-A尾的方式增加其稳定性。为了达到在体内将mRNA转导入T细胞内的目的，作者使用了脂质纳米颗粒（LNPs）作为mRNA的载体；此外，LNPs表面修饰了CD5单抗，使其能够特异性的结合T细胞（少量靶向B细胞，且不影响T细胞正常功能）并通过胞吞作用进入其中，进而将内部包裹的mRNA释放出来，在细胞质中发挥其翻译功能，从而使T细胞成为有功能的CAR-T细胞（图2A）。

图2：靶向 CD5 的 LNP 在体外产生功能性的、基于 mRNA 的 FAPCAR T 细胞

工具构建完成后，作者首先通过细胞试验对其功能进行检测。作者分别设计了IgG包被的LNPs和CD5包被的LNPs以检测CD5的靶向性。将包裹mRNA的LNPs与小鼠T细胞共培养48h后，通过流式细胞技术检测表达GFP/FAPCAR的细胞数量。可见CD5包被的LNPs可将mRNA转导到大部分T细胞中，其中暴露在CD5/LNP-GFP中48小时后，81%T细胞表达GFP（图2B）；暴露在CD5/LNP-FAPCAR中48小时后，83%T细胞表达FAPCAR。但使用IgG包被的LNPs不能有效的将mRNA转导入T细胞中（图2B-D）。这些通过LNPs生成的CAR-T细胞和使用逆转录病毒的得到的CAR-T细胞一样，能够以剂量依赖性的方式有效的杀死表达FAP的靶细胞（图2E）。

图3：靶向 CD5 的 LNP 在体内产生基于 mRNA 的 FAPCAR T 细胞。

为了评估靶向CD5的LNP mRNA能否在体内有效的编辑T细胞，作者将含有荧光素酶mRNA的CD5/LNPs通过尾静脉注射至小鼠体内，并检测其脾脏中T细胞的荧光素酶活性。尾静脉注射CD5/LNP-Luc的小鼠脾脏T细胞的荧光素酶活性明显高于同型对照（图3A）。在另一项实验中，将装载Cre重组酶mRNA的CD5/LNPs注射至Ai6-Cre报告小鼠中，作者发现实验组动物的CD3+细胞（包括CD4+T细胞、CD8+T细胞）中存在特异性基因重组，而CD3-细胞（主要包括B细胞、树突样细胞、巨噬细胞等）中基本检测不到该特异性基因重组，再一次证明了CD5/LNPs的特异性靶向能力（图3B）。

在血管紧张素II/肾上腺素（AngII/PE）诱导的损伤组小鼠中进行的实验中可以看到，在注射CD5/LNP-FAPCAR 48h后，小鼠脾脏中成功分离出FAPCAR+的T细胞（17.5%-24.7%）（图3C-D）。

 

图4：FAPCAR T 细胞吞噬来自活化的心脏成纤维细胞的 FAP，仅在 AngII/PE 损伤的 FAPCAR T 细胞治疗的动物中将 FAP 返回脾脏。

为了验证CD5/LNPs-FAPCAR在体内重编程生成的CAR-T细胞和体外通过逆转录生成的CAR-T细胞拥有同样的作用机制，作者首先将通过体外病毒逆转录工程得到的FAP CAR-T细胞与过表达红色荧光蛋白（RFG）标记FAP的人胚胎肾细胞（HEK293T）共培养，并通过共聚焦显微镜观察细胞行为（图4B）。接下来作者通过AngII/PE造模损伤小鼠，并给予GFP标记的FAPCAR-T细胞处理，可见损伤组脾脏白髓观察到荧光标记，阴性对照组及其他实验组并未观察到该现象（图4C）。进一步放大观察，可见损伤+处理组的FAP+细胞与GFP荧光存在共标现象，且与细胞实验所得到的图像非常类似（图4D）。而损伤+CD5/LNP-FAPCAR处理组也观察到了类似的共标现象，证明作者通过CD5/LNP-FAPCAR重编程得到的CAR-T细胞和传统方法合成的FAPCAR-T细胞拥有相同的功能。（图4E）

图5：体内产生瞬时 FAPCAR T 细胞可改善损伤后的心脏功能。

接下来作者评估了CD5/LNP-FAPCAR能否改善损伤小鼠的心肌功能。可以看到在给予小鼠2周CD5/LNP-FAPCAR治疗后，实验组小鼠的舒张末期心室容积、收缩末期心室容积获得明显改善，虽然归一化左室质量并未恢复至损伤前水平，但较未处理组扔去的一定好转（图5B-D）。此外，左室舒张功能基本恢复至损伤前水平（E/e`），而左室射血分数和整体纵向应变的数据结果也证明左室收缩功能基本恢复至损伤前水平，超声心动图也证明了该结论（图5E-H）。小鼠心肌切片的天狼星红染色也可以看到CD5/LNP-FAPCAR治疗后的小鼠心肌纤维化明显得到改善（图5I-J）。

总结：

该团队构建了能够包裹mRNA，并且拥有靶向性的脂质纳米颗粒（LNP），并证实其能够在体内进行进行T细胞的重编程，并使体内重编程的T细胞正常的发挥作用，有效降低了心衰小鼠心肌纤维化程度，改善其心功能；并且通过将mRNA限制在细胞质内，使其无法进行基因组整合，解决了FAPCAR-T细胞持续存在所导致的影响伤口愈合时成纤维细胞无法正常工作的副作用。该技术为CAR-T细胞疗法开辟了全新的思路，也为癌症及非癌类疾病的CAR-T细胞疗法提供了理论基础。

Torahito A. Gao,Yvonne Y. Chen,T cells to fix a broken heart, Science, 375, 6576, (23-24), (2022).doi/10.1126/science.abn0851