JACS | 赭曲霉素A适配体高亲和力的结构基础

    今天分享的是近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的一篇文章，标题为Structural Insights into the Mechanism of High-Affinity Binding of Ochratoxin A by a DNA Aptamer。

有关作者：

        本文的通讯作者为中国科学院生态环境研究中心的赵强研究员和精密测量科学与技术创新研究院的李从刚研究员，两位研究员的科研方向分别为化学/生物分析/传感和原位生物大分子波谱分析。

研究背景：

        赭曲霉素A（图1A, OTA）是一种造成食物污染的霉菌毒素，具有肾毒性和致癌性，对人类和动物的健康造成严重威胁。因此，OTA的检测对食品安全、环境监测和风险评估具有重要意义。

        适配体有利于实现OTA的生物传感和亲和萃取。OBA36（图1A）是一种富含鸟嘌呤的OTA适配体，其对OTA的解离常数为~50 nM，而对赭曲霉素B（将OTA异香豆素环上的氯原子替换为氢原子，简称OTB）的亲和力则比OTA低100倍，能够在单个原子的水平上实现对OTA和OTB的区分。然而，OBA36对赭曲霉素的高亲和力和特异性的结构基础仍不明晰。

        本文作者通过核磁共振波谱实验解析了OTA-适配体复合物的高分辨率结构，揭示了该适配体对OTA亲和力及特异性的分子机制，有利于设计和改良基于适配体的生物传感器。

图1. OTA与适配体OBA36、OBA32的一维核磁氢谱。

结果与讨论：

      作者首先在类似适配体筛选的条件下以OTA对OBA36进行了滴定（图1B）。随着OTA的加入，OBA36核磁谱图的信号变窄，在10-14 ppm出现了新的信号，且1当量以上的OTA加入后核磁谱图没有进一步的变化，说明OTA与OBA36以1:1的比例形成了包含G-四链体和双链的结构。

      为了简化核磁谱图，作者尝试去掉OBA36的3′端的4个核苷酸，得到更短的OBA32序列（图1A）。OBA32对OTA的结合能力与OBA36相似，且滴定的核磁谱图也呈现出类似的特征（图1C），因此作者转而分析OBA32-OTA复合物的结构。

    在完成核磁信号的归属后，作者从二维NOESY谱（图2A）分析OBA32-OTA复合物的拓扑结构。该复合物中存在由G7·G26·G16·G13 和 G8·G12·G17·G25 tetrads堆积形成的反平行G-四链体结构（图2B-C），分别由图2A中蓝色和红色标出的NOE信号佐证。两层G-tetrads由T9-G10-T11、G14-T15和C18-G19-T20-A21-A22-A23-G24环连接，环与环之间形成G10·G24·C18 triple和T11·A23反Hoogsteen碱基对（图2B-C）。G2-A3-T4和 A30-T31-C32形成了该复合物的双链部分。OTA分子（图2C中粉红色部分）结合在双链与G-四链体的连接处，由OTA与T4、T15、A27、G28、C29、A30的分子间NOE佐证。

图2. 由NOESY谱分析OBA32-OTA复合物的拓扑结构。

        基于图2C的结构，作者进一步在OBA32的5′端加上一个胞嘧啶使之与G33配对，得到OBA33的序列。与OBA32相比，OBA33对OTA的亲和力更强，且复合物的核磁谱图质量更高，因此，作者基于核酸实验得到的约束计算了OBA33-OTA复合物的三维空间结构（图3）。

图3. OBA33-OTA复合物的三维空间结构。

        与OBA32-OTA复合物类似，OBA33-OTA复合物以双链和G-四链体作为支架（图3）。G10·G24·C18 triple和T11·A23碱基对堆积在G-四链体上，进一步稳定G-四链体结构。此外，G19·A22也形成碱基错配。

图4. OTA结合口袋的结构细节。

        在OBA33-OTA复合物中，G6·T15·A27·C29 quartet、C5·T15·G28 triplet、A30-T4碱基对和G14、T4、C5形成了结合OTA的口袋（图4A-B）。A30-T4碱基对、OTA中的异香豆素环和G28之间的堆积作用（图4C）、OTA中的氯原子与C5芳香环之间的卤键（图4D）以及OTA与A27、G28、C29之间的疏水作用（图4E）将OTA分子固定在适配体OBA33的口袋中。

        作者将OBA系列适配体对OTA与OTB的区分能力归结于OBA-OTA复合物中卤键的形成。卤键是卤素原子与电子供体之间形成的具有方向性的非共价作用。电子供体通常为电负性的氧、氮、硫原子以及芳香环或π共轭系统。在OBA33-OTA复合物中，OTA的氯原子与C5碱基之间的平均距离为3.2 Å，且C-Cl键与C5平面法向量之间的平均角度为26°，这表明OTA与OBA33之间形成了较强的卤键，对OBA33-OTA复合物有较强的稳定作用。

总结：

1. OBA系列适配体结合OTA分子的结构基础：OTA通过卤键、堆积作用及疏水作用结合在双链与G-四链体的连接处。

2. OTA与适配体之间的卤键是适配体亲和力与特异性的决定性因素。

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c00478

Xu, G.; Zhao, J.; Yu, H.; Wang, C.; Huang, Y.; Zhao, Q.; Zhou, X.; Li, C.; Liu, M., J. Am. Chem. Soc. 2022, 144 (17), 7731-7740.