NAT BIOMED ENG丨Input序列不受约束的多臂RNA连接编码的分子逻辑器用于无细胞诊断

大家好，今天分享的文献是2022年3月发表在nature biomedical engineering上的“不受序列约束的多臂RNA连接编码的分子逻辑用于无细胞诊断”。

有关作者：

本文作者是波士顿大学生物医学工程系的Alexander A. Green教授，实验室主要方向包括RNA网络设计的细胞传感和计算系统，低成本便携式病原检测，新型抗菌材料和涂料，二维材料的化学改性等等。曾于2010-2014年在尹鹏课题组学习，比较有代表性的两篇关于Toehold switch以及将其用于细胞内的逻辑计算的文章也是和尹鹏老师合作发表的。本篇文献是Toehold switch 的改进与便携检测的结合。

研究背景：

• 先前报道的基于Toehold switch的逻辑系统的局限性

Alexander A. Green教授2014年发表的cell中提出了一种新的核糖调控机制，不同于传统调节方式将RBS序列完全互补，而是trigger RNA 通过单链Toehold区域与具有翻译抑制发夹结构的开关 RNA 结合，触发结合导致开关 RNA 茎展开，从而暴露核糖体结合位点 (RBS) 和起始密码子以激活输出基因的翻译，同时起始密码子AUG上方的stem被设计为低CG含量的序列，以保证正常的核糖体结合与翻译开启，这样的设计极大地拓展了上游trigger RNA的设计，能够实现更多的mRNA控制基因表达功能。

随后在2017年，作者构建了可以进行二输入 OR、二输入 AND 和 A AND (NOT B) 运算的核糖计算电路，这些运算构成了功能完整的布尔逻辑运算符集，使复杂的细胞内计算能够通过可编程的RNA分子完成（当然对toehold switch的stem长度和loop做出了一些长度的调整以适应逻辑门构建）。然而，迄今为止开发的核糖计算元件有几个关键限制，限制了它们可以监测的输入 RNA 的范围和它们可以产生的输出蛋白质的范围。AND 门依赖于多个输入 RNA 之间的互补杂交，限制了天然mRNA作为input的使用。OR 逻辑元件需要长的开放阅读框，其具有高度二级结构，紧邻输出基因序列的上游, 这些区域会阻碍核糖体的持续合成能力，导致输出基因的表达水平受input RNA的水平和种类影响很大，并导致扩展的 N 末端肽延伸，对输出蛋白质折叠产生不可预测的影响。解决这些限制需要启动 RNA-RNA 相互作用的替代方法，以减少序列限制和改进编码分子逻辑的策略，以最大限度地减少它们对输出基因序列的影响。

• 低成本便携的检测系统

作者之前开发了低成本的便携式诊断仪，可用于在资源匮乏的环境中检测病原体。这些测定利用体外无细胞转录-翻译系统稳定嵌入纸质基材中，并与快速等温核酸扩增反应耦合。这些功能使测试能够在有限的设备上实施，提供直接可观察到的结果。这些检测的一个关键组成部分是工程化的核酸传感器，它能够高灵敏度和高特异性检测目标 DNA 和 RNA。Alexander A. Green教授团队致力于将其用于寨卡病毒、诺如病毒、埃博拉病毒和 HIV 等病原体的测试。

整体设计：

作者使用多臂连接调节基因表达的基本设计如上图所示。这种调节结构会形成强二级结构，使得被隐藏在其中的RBS很难被核糖体结合，起始密码子AUG很难被发现，因此翻译被抑制。该结构的茎环臂充当传感器，为每个input RNA 提供结合位点。针对不同的逻辑门，会对其传感器臂的长度和数量进行调节。OR 门的传感臂较短，保持“解锁”状态并可用任意一条input RNA 结合,将传感器臂展开到基干以激活翻译。AND 门，除了一个传感器臂之外的其他传感臂都被加长，以建立一个“锁定”的设置，防止相应input RNA 结合解开。连续输入的input和解锁最终导致 RNA 链完全解开，从而激活下游基因的翻译。与之前的方法相比，本文的方法避免了用于 AND 门的input RNA 之间需要序列互补。此外，OR门中生成的output protein 避免了生成冗余的N端。作者使用多臂连接的调节器在大肠杆菌中实现三输入 AND 和 OR 操作使用完全独立于序列的输入 RNA。将这些系统移植到基于纸张的无细胞转录-翻译反应中，用于病毒检测。

结果与讨论：

1，环引发的翻译激活：

在以往的设计中，单链toehold引发下游的翻译，在本文设计中，则需要长loop domain能够行使类似的作用，提供RNA相互作用的热力学驱动力以及提供并在input RNA序列不受限制的情况下利于其快速结合。当设计的input RNA(与a,b互补)与调控元件结合时，破坏up stem的互补配对，使得RBS暴露，引发下游翻译。

作者使用 NUPACK 软件包从头设计了 24个不同 LIRA 序列的文库，并构建质粒，采用绿色荧光蛋白 (GFP) 作为报告蛋白， 24个 LIRA 中有 16 个有超过50 倍的 ON/OFF 比率。在无input时，有一定泄露。为了检测它们在多臂接头中的使用，作者通过测量在提供最宽动态范围的 16 个元件之间观察到的串扰来评估 LIRA 正交性，发现来自非同源输入的串扰非常低，几乎在所有情况下都低于 4%。并且可以通过调整input结合部位的序列，完成对于编码其他蛋白mRNA的检测。

2，用于体内分子逻辑的多臂 RNA 连接

在开发了一组无序列约束的正交 LIRA 之后，作者接下来将它们作为传感器模块集成到多臂 RNA 连接结构中，用于计算细胞内 OR 和 AND 逻辑表达式。生成的逻辑门 RNA 的传感器臂均由不同的 LIRA 模块覆盖，并设计用于在输入 RNA 与门 RNA 结合时指导调控元件的展开。图a是一个双输入 OR 逻辑器件，其顶部是 LIRA 臂，以提供结合位点用于input相互作用。深蓝色的发夹重构结构域用于维持mRNA单链状态以并提供了更大的空间以更好地容纳核糖体转录。在转录过程中，发夹结构域还可以帮助延迟强 LIRA 茎环结构的形成，以阻止转录终止。同理作者还使用三个正交 LIRA 模块构建了一个三输入OR门 RNA（图d）。该电路在体内也按预期执行，对于空输入逻辑 FALSE 情况的表达低，当输入 RNA 时，表达增加 6 到 19 倍以任何组合表示（图e，f）。

接下来作者通过设计不同强度的传感器臂来实现锁定和解锁的 LIRA，设计了双输入和三输入的AND 门（图a,d）。双输入AND门 RNA 包含一个基臂，一个在上游的，较弱的未锁定 LIRA 模块 A*用于与inputA结合、一个距离RBS更近的强锁定LIRA 模块 B*，锁定臂在RNA双链结构中包含了RBS 和起始密码子AUG。此时仅输入B是不足以解锁整个结构的，锁定的茎环结构在热力学上有很强的稳定性，而在输入A之后，它的结合力足够强，可以破坏门 RNA 的左边茎环进而展开基干依次解锁 LIRA B* 模块，使其与输入 B 互补，此时RBS 和起始密码子被暴露以翻译 GFP 报告基因。作者还开发了四臂连接的三输入AND门，大部分设计与双输入AND门类似，其中为了增加翻译输出并促进二级结构的解开，将发夹重构域添加到input A 和 C 的臂。两种AND门都实现了在大肠杆菌中的正常工作。

3，验证 LIRA在试纸诊断上的可行性

 作者希望将LIRA 和多臂连接 RNA 结构的逻辑传感功能用于无细胞纸质诊断，试纸上是冷冻干燥的无细胞转录-翻译反应系统以及酶反应显色系统。在使用时，用含有 RNA 的溶液湿润试纸，以便通过嵌入的 LIRA 核糖调节器进行检测。由于细胞内系统与无细胞系统的差异，为了增加翻译输出并促进茎环解开，在每个 LIRA 传感器的 5' 端添加了一个发夹重构结构域（图b）。将5 µM合成病毒 RNA 靶标应用LIRA 病原体传感器检测，能够观察到明显的颜色变化。

为了能够检测临床样本中通常存在的浓度的 RNA，作者使用基于核酸序列的扩增 (NASBA) 来放大低浓度病原体 RNA，然后再用于试纸检测。不论是合成靶标还是临床样本均能准确地检测出登革热病毒。用于NASBA的最低靶标浓度为20 aM，相当于12 copies RNA/μL。

4，整合逻辑门的试纸诊断

为了证明这种基于逻辑门的试纸检测的潜力，作者利用多臂连接逻辑门对HIV 和 SARS-CoV-2检测作为验证，设计了对应的双输入OR 门，双输入AND门实现试纸检测，并将其用于临床样本检测。作者测试了来自 SARS-CoV-2 患者的六个阳性唾液样本和六个阴性唾液样本。图h说明了从样品处理到试纸检测的过程。稀释的唾液样本在 95°C 下进行短暂的加热 2 分钟以释放病毒 RNA，然后添加到 NASBA 反应中以扩增每个输入的 RNA，用于试纸检测，如图i所示，AND 门检测到六个阳性样品，产生清晰可见的紫色，而六个阴性样品保持黄色。

总结：

1， 环启动的RNA激活子（LIRA）可以作为核糖调节剂，具有宽动态范围，良好的正交性和较低的翻译泄漏。

2，LIRA实现了inputRNA序列与output RNA序列几乎无相关性，降低了设计的序列约束。

3，在细胞体系（E.coli）与无细胞试纸检测体系中均实现了双输入OR和双输入AND门，并将无细胞系统应用于多种病毒的可视化检测。

Ma, D., Li, Y., Wu, K. et al. Multi-arm RNA junctions encoding molecular logic unconstrained by input sequence for versatile cell-free diagnostics. Nat. Biomed. Eng 6, 298–309 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00857-7