NUCLEIC ACIDS RES丨分子亲和力标尺：DNA适配体在ELISA应用中的系统性评价
大家好，今天分享的文献是发表在Nucleic Acids Research上的“分子亲和力标尺：DNA适配体在ELISA应用中的系统性评价”，作者是新加坡生物工程与纳米技术研究所的Ichiro Hirao研究员。
研究背景：
自2015年以来，核酸适配体的制备和应用的报道每年超过1000例。然而，只有少数一些类型的适配体具有实际用途。核酸适配体的亲和力不同,典型的核酸适配体与蛋白质结合的KD值的范围是10-12 – 10-6 M。到目前为止，还没有报道系统地研究适配体亲和力与实际应用之间的关系。为此，需要制备一系列具有不同亲和力的适配体以相似的结合方式结合到目标分子的同一区域，作为分子亲和力的标尺。然而，利用传统的适配体技术制备这种适配体并不容易，因为它们的亲和力有限。
先前，该研究组在DNA适配体中引入两个疏水的非天然碱基(Ds)，分别制备了靶向血管内皮细胞生长因子165 (VEGF165)和γ干扰素 (IFNγ)的非天然DNA (UB-DNA)适配体，V-Apt1和I-Apt1，可以显著增强适配体对靶标的亲和性。用天然碱基A替换Ds碱基后得到的适配体的亲和力降低。通过用A碱基替换Ds碱基，研究人员制备了两组具有不同亲和力的DNA适配体，分别靶向VEGF165和IFNγ。利用这些分子亲和性标尺（适配体），他们评估了不同亲和力的适配体在酶联免疫吸附实验(ELISA)中的应用。
图1：含有两个Ds碱基的抗VEGF165和抗IFNγ的适配体。
图2：分子亲和性标尺: 通过用碱基A替换碱基Ds，得到了一系列具有不同亲和力的适配体变体。适配体的结合亲和力参数由Biacore T200分析确定。
结果与讨论：
分子亲和性标尺的制备:准备一系列具有不同KD值的DNA适配体
此前，通过引入两个非天然的Ds碱基研究人员报道了的抗VEGF165和抗IFNγ的核酸适配体(V-Apt1 (DD)和I-Apt1 (DD))。通过用A碱基替换1个或2个Ds碱基，获得一系列具有不同亲和力的适配体，其以相似的结合方式结合到目标分子的同一区域。
使用该分子亲和力标尺进行凝胶电泳实验
他们通过传统的凝胶电泳实验评估适配体与靶标蛋白的结合能力，验证分子亲和力标尺的特征。将靶标蛋白与适配体混合，在不存在或存在尿素的条件下进行电泳。实验结果表明，非天然碱基Ds的掺入，可增加适配体的稳定性。此外，与I-Apt适配体系列相比，V-Apt适配体系列产生了较大的位移。在尿素条件下，I-Apt3 (DA)、IApt4 (AA)和I-Apt2 (AD)与靶蛋白结合的迁移带的密度均显著降低。研究人员推测这是由于尿素破坏了适配体结构以及与靶蛋白的相互作用。
图3：凝胶电泳分析。
在酶联寡核苷酸测定法(ELONA)中利用适配体作为靶标蛋白的一抗检测剂
在进行ELISA实验前，他们验证了核酸适配体对靶蛋白的结合能力。靶标蛋白直接被固定在孔板表面，加入生物素化的适配体结合靶标。采用链霉亲和素HRP偶联试剂进行TMB反应，比色输出检测信号。对VEGF165的检测来说：所有适配体在不同的蛋白浓度下均可检测到目标蛋白，但检测灵敏度不同；例如靶标浓度为5 nM时，信号强度由强到弱，依次为V-Apt1，V-Apt2，V-Apt3，V-Apt4。针对IFNγ的检测来说：只有I-Apt1 (DD)可检测到靶标蛋白的信号，而其他Ds➟A的适配体变体几乎检测不到靶标蛋白的信号。总的来说，适配体的灵敏度与其结合亲和力(KD值)有关。
一般情况下，这种直接固定靶标分子的方法灵敏度较低，应用受到限制，因此，他们下一步研究了使用适配体-抗体组合的ELISA实验。
用于三明治型靶标检测的单克隆抗体-适配体对
为了找到合适的单克隆抗体(mAb)和适配体对，研究人员通过凝胶电泳实验筛选了市购的单克隆抗体(mAbs): 靶向VEGF165的26503、VG76e、16F1和VG1, 靶向IFNγ的B133.5和2G1。通过实验，他们筛选得到了靶向VEGF165的单克隆抗体26503和靶向IFNγ的单克隆抗体2G1和B133.5。有趣的是，单克隆抗体2G1和B133.5之前曾被用作抗体-抗体三明治对。因此，DNA适配体I-Apt1 (DD)和两种单克隆抗体2G1和B133.5结合在IFNγ的不同区域。
在三明治型ELSA实验中评估适配体，他们主要考虑两个因素：检测灵敏度（LOD）和信号强度（OD450）。
使用适配体作为一抗检测剂的三明治型实验检测靶标蛋白
在三明治型实验中，他们使用单克隆抗体mAbs (抗VEGF165的26503和抗IFNγ的B133.5)作为目标蛋白的捕获剂进行固定。将靶标蛋白溶液加入到固定mAbs的孔板上，洗涤复合物后，加入适配体作为检测剂。随后与链霉亲和素-HRP偶联试剂混合进行比色检测。实验结果表明，检测灵敏度(LOD)和信号强度(OD450)与适配体的结合亲和力密切相关，并且检测方法改进后检测灵敏度大大提高。采用抗体2G1和B133.5检测IFNγ的抗体-抗体对的灵敏度(LOD = 0.21-0.76 pM) 与V-Apt1、V-Apt2、I-Apt1的适配体-抗体对(LOD = 0.18-0.23 pM)相近。为达到相似的灵敏度，与抗体(KD = 66-280 pM)相比，适配体的需要更高的亲和力(KD ~10 pM) 。
使用适配体作为捕获剂的三明治型实验检测目标蛋白
接下来，他们分析了适配体作为捕获剂的目标蛋白检测效果。将适配体溶液(1 nM或150 nM)涂到有链霉亲和素的孔板上进行固定。洗涤去除未结合的适配体后，加入目的蛋白。再次洗板后，加入单克隆抗体检测剂，用抗IgG的二抗小鼠酶标抗体检测信号。研究发现，当使用低浓度(1 nM)的适配体溶液进行固定化时，VEGF165和IFNγ都可以通过各自的适配体进行检测。每个适配体的检测灵敏度和信号强度与各自的适配体亲和力相关。令人惊讶的是,当浓度较高(150 nM)的适体溶液被用于固定时，在检测中可观察到相反的信号强度趋势。对V-Apt1 (DD)，VApt2(AD)，I-Apt1 (DD)和I-Apt2(AD)来说，当用高浓度的适配体进行固定时，它们的信号强度下降。相反，亲和力弱的适配体V-Apt4 (AA)和I-Apt4 (AA)以及V-Apt3 (DA)，当用高浓度的适配体进行固定时，信号强度增加。
为了研究适配体的灵敏度和信号强度对高浓度的被固定的适配体的依赖关系，他们用不同浓度的适配体 (从1 nM到150 nM)制备孔板，检测了不同浓度适配体V-Apt1 (DD)、I-Apt1 (DD)和V-Apt4 (AA)、I-Apt4 (AA)的信号强度。实验发现低亲和力的核酸适配体V-Apt4 (AA)和I-Apt4 (AA)表现出一般的趋势：信号强度随被固定化的适配体浓度的增加而增加；相比之下，高亲和力的Ds-DNA适配体，V-Apt1 (DD)和I-Apt1 (DD)的信号强度随被固定化适配体浓度的增加而降低。他们推测原因是：被固定的适配体之间的分子间相互作用阻碍了适配体与靶蛋白的结合。当适配体与适配体在二维平板上的距离较短时，水溶液中Ds-DNA适配体中疏水Ds碱基之间的相互作用增强。此外，链霉亲和素对生物素有4个结合位点，因此生物素化的适配体可能彼此之间的距离非常近。
在此基础上，他们改进了固定方法：用抗生物素IgG代替链霉亲和素包裹在孔板表面。虽然IgG有两个结合位点，但IgG的尺寸(~150 kDa)大于链霉亲和素的尺寸(53 kDa)。因此，与抗生物素IgG结合的适配体之间有足够的距离，这可能阻止了适配体之间的相互作用。试验后发现，这种固定方法大大增加了所有适配体的信号强度，并且该方法大大提高了V-Apt4 (AA)、I-Apt3 (DA)和I-Apt4 (AA)等低亲和力适配体的LODs。
最后，他们检验了ELISA/ELONA系统在血液检测（含10%血清）中的实际应用。实验条件：将核酸适配体固定在链霉亲和素包裹的孔板表面孵育30分钟，适配体浓度：1 nM in 1 × binding buffer (100 μl per well)。然后用靶标溶液(100 μl per well, in 1× binding buffer or 10% HS / 0.9× binding buffer)按指定浓度进行孵育。适配体-靶标结合后，加入100 μl的检测溶液（10 nM each monoclonal antibody in 1× binding buffer），孵育30分钟。孵育后，100 μl的二抗检测溶液（50 ng/ml HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody in 1× binding buffer）加入到孔板中，孵育30分钟。洗涤后，TMB反应15分钟。实验结果表明，血清的存在对高亲和力适配体的靶标检测影响不大，说明血清并未抑制适配体与靶标的结合。然而，使用低亲和力适配体，10%的人血清条件降低了ELISA的信号强度。
总结：
1. 在该工作中，研究人员制备了两套DNA适配体，其KD范围是10-12-10-8 M；
2. 利用这些适配体，研究人员评估了DNA适配体在ELISA/ELONA实验中的灵敏度：实验结果表明适配体亲和力(KD值)与其检测灵敏度之间存在明显的关系；
3. 在评价实验体系时，研究人员考虑两个因素：检测灵敏度(LOD)和信号强度(OD450)；
4. 由核酸适配体组成的分子亲和力标尺对改进检测系统有一定的参考价值，如DNA适配体固定化方法的改进大大提高了检测灵敏度和信号强度；因此，使用KD值不同的适配体系列作为分子亲和性标尺的方法，可用于评估所需适配体的亲和性，以及在各种实验、实际应用中的器件灵敏度。
Kimoto, Michiko, Yun Wei Shermane Lim, and Ichiro Hirao. "Molecular affinity rulers: systematic evaluation of DNA aptamers for their applicabilities in ELISA." Nucleic acids research 2019, 47 (16): 8362-8374. doi.org/10.1093/nar/gkz688
