NAT CHEM BIO丨使用DNA链置换电路对无细胞生物传感器进行编程
大家好！今天给大家分享一篇2022年4月发表在Nature Chemical Biology上的一篇题目为《Programming cell-free biosensors with DNA strand displacement circuits》的文章。
通讯作者是来自西北大学化学与生物工程系的Julius B. Lucks教授。Lucks教授课题组的研究灵感主要基于生物体内固有的一些调控机制，比如RNA通过动态折叠实现对细胞转录的精确调控。对于这些细胞固有的动态调控机制，如果在体外对其中一些重要调控组分进行重新组合，可以得到一个无细胞的体外转录合成系统。这些无细胞体系经过改造优化，能够在体外行使生物传感器的功能。无细胞的生物传感器能像全细胞传感器一样接收外界样品中的输入信号，经过一系列生物合成反应后，输出可被检测的光信号、电信号等。无细胞生物传感器成本低廉，没有生物安全问题，并且随着冻干技术的升级，冻干的无细胞生物传感器更容易携带，因此在便携式检测场景中有着广阔前景。然而，现有的无细胞传感器往往缺少信息处理的能力，因此不具备全细胞传感器的阈值激活、逻辑分析等功能。在本篇文章中，作者基于DNA链置换计算电路构建了一个通用型信息处理层，并将其添加到前期构建的一个名为ROSALIND的无细胞生物传感器体系中，拓展了无细胞生物传感器的功能，使其具有了对输入信号进行逻辑分析的信息处理能力。
无细胞生物传感器ROSALIND
在ROSALIND（配体诱导激活的RNA输出传感器，RNA Output Sensors Activated by Ligand Induction）的初始版本中包含有RNA聚合酶，变构转录因子和DNA转录模板，这些组分暴露于特定的配体时，会转录生成荧光激活的RNA适配体，在几分钟内可观察到荧光响应信号。而在本篇研究里的ROSALIND，这些输出的RNA不通过与发色集团的结合而发光，而是进入一个基于toehold介导的DNA链置换计算电路（toehold-mediated DNA strand displacement，TMSD），在完成逻辑分析或者信号比较后再进行荧光信号输出。
基于DNA链置换的计算电路与无细胞生物传感器ROSALIND的整合
为了实现TMSD与ROSALIND的整合，作者首先验证了单链RNA能否与DNA信号门发生链置换反应。与单链DNA形式的侵入链一样，纯化的单链RNA也可以有效地与DNA信号门发生链置换反应，产生荧光信号。并且体外转录体系能够在DNA信号门存在时依然顺利转录出RNA侵入链。之后，作者开始对RNA侵入链InvadeR进行结构优化以达到更快的信号输出。他们设计了5个二级结构和稳定性都不尽相同的InvaderR来观察它们的荧光动力学情况，结果表明，稳定性最低的variant3的荧光输出最快，而稳定性次之的variant2荧光动力学反应速度也次之，而二级结构最稳定的variant1的反应最慢。而改造后稳定性更强的variant3和variant2的荧光动力学则明显低于未改造前，说明TMSD的反应动力学可以通过改造RNA侵入链的二级结构进行调节。
RNA侵入链的二级结构影响TMSD的反应效率
随后，作者用TetR验证了RNA侵入链的转录调节情况。TetR的结合序列tetO插入位置位于T7启动子和InvadeR序列之间，而要实现有效的转录调节，tetO与启动子之间的间隔需要精确控制。结果表明，当spacer的长度在2bp左右的时候信噪比最高。当加入不同浓度的TetR的配体aTc，该IVT系统有明显的从低到高的信号输出，aTc的浓度在2.5 和 5μM之间的时候可以达到信号响应最大值的一半。
TetR转录因子对RNA侵入链的转录调节
接着作者尝试用各种不同逻辑门的组合实现在体外转录系统中的逻辑运算。OR的运算可以通过两个并列的IVD体系实现，它们的转录因子分别两种不同的配体分子产生响应。当两种配体分子其中任何一个存在时，都可以转录生成OR门的RNA输入链，这两种输入链通过该OR门可以产生相同的输出链与信号门反应，因此两者都可以达到相同的荧光输出。AND的运算则借助了一个需要两种配体分子同时存在才可以释放输出链的AND门。为了使TMSD能够顺利进行， AND门中引入了一小段错配区域，从而使得二级结构丰富的RNA输入链与AND门的链置换反应能够被热力学驱动。除了AND和OR门之外，作者还尝试构建了更复杂的NOT门。在不存在相应配体分子时，OR门不会被它的IVD体系转录出来，因此另一个生成InvadeR的IVD体系能够和信号门反应产生信号，而在在检测到配体分子时，OR门得以转录生成，InvadeR无法与信号门反应，体系荧光信号会明显降低。为了解决NOT门设计中遇到的配体分子产生的非特异性信号的问题，作者采用三种限制InvadeR与信号门反应的策略：(1)在NOT门中引入比信号门更长的toehold；(2) InvadeR与NOT门配对碱基数目比信号门更长；(3)InvadeR与信号门的分支迁移区域存在不完全的碱基配对。通过以上三种策略的共同作用实现了无细胞生物传感器的NOT逻辑门功能。
无细胞生物传感器中的逻辑运算
接着作者尝试构建多层逻辑门的组合实现更复杂的逻辑运算，比如NAND，IMPLY。在IMPLY的体系中，作者用了三种IVT体系，其中一个始终能够转录生成InvadeR，而另外两个则分别在ZnSO4和Tet存在时转录出对应的RNA链。以ZnSO4为配体分子的IVT体系转录出得RNA链能够与InvadeR优先结合（采用的是和前述NOT门同样的三种策略），因此阻断了在ZnSO4存在时荧光信号的输出。而在NAND门中要求两种配体同时存在时不输出荧光信号，因此每种配体分子对应两个IVT体系，分别负责信号链的生成和阻断。在没有对应配体分子时，信号链能够与信号门发生链置换输出荧光，而当对应配体分子存在时，另一个IVT体系会会启动转录生成信号链会优先结合的RNA门，因此信号链与信号门的链置换被阻断，而当两种配体分子同时存在时，两个信号链的生成被同时阻断，体系就不会有荧光信号的输出。
无细胞生物传感器中的复杂逻辑运算
现有的无细胞生物传感器通常无法对靶标浓度进行定量分析，而只能给出有/无的检测结果，所以作者尝试用链置换电路在无细胞生物传感器中进行生物靶标的浓度分析。作者在体系中引入了一个阈值门，当RNA链被转录出来之后会优先跟阈值门发生链置换反应，所以它与信号门的反应就会被延迟。而在不同的阈值门浓度下信号延迟情况会有所不同，但是都与动力学模拟的结果有比较好的吻合。根据这个特点，作者设置了一组阈值门浓度梯度增加的反应体系。因为更高的阈值门浓度需要更高的配体浓度来激活荧光，因此可以根据这组反应体系的荧光激活情况对靶标浓度进行半定量分析。
无细胞生物传感器对靶标浓度的半定量分析
总结：作者利用了精巧的TMSD网络设计拓展了无细胞生物传感器的逻辑运算功能，实现了无细胞生物传感器对靶标检测的同时进行逻辑运算。除了和更复杂的DNA计算电路结合实现更复杂的计算功能外，无细胞生物传感器还可以实现对生物靶标的浓度分析，并且具有响应速度更快（检测时间在10 min以内）等优势。
Jung, J.K., Archuleta, C.M., Alam, K.K. et al. Programming cell-free biosensors with DNA strand displacement circuits. Nat Chem Biol 18, 385–393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9
