PNAS丨一种无需负筛的高通量特异性多靶标核酸适配体筛选系统
大家好，今天分享的是2022年3月发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》上的一篇文献，标题为：A system for multiplexed selection of aptamers with exquisite specificity without counterselection。通讯作者为斯坦福大学的H. Tom Soh教授。Soh课题组的研究方向主要包括：功能分子的体外定向进化、生物传感器和集成分子诊断以及基于微流控的生物分离和细胞分选技术等。
核酸适配体是一类能与靶分子特异性结合的单链寡核苷酸。适配体已被证明是检测小分子的重要工具之一，因为它们具有显著区分结构相似分子的识别能力。为了筛选得到具有高度特异性的核酸适配体，传统的筛选方法通常在指数富集配体进化系统（SELEX）中引入负筛（针对靶标的类似物或干扰物），来消除对干扰物或与目标分子结构相似的类似物具有交叉反应性的适配体。然而，由于适配体文库的亲和力和特异性特征基本上是先验未知的，因此只能通过不断试错来确定最佳的负筛条件。此外，这些方法本身效率低下，可能无法产生亲和力和特异性最佳组合的适配体。
针对这一问题，作者们提出了一种高通量的筛选过程，该方法不需要负筛实验就可以对一组相似结构的靶标进行高特异性的适配体筛选。如图1所示，该方法主要包括以下三个流程：
图1 高通量特异性筛选平台概述
（1）多靶标适配体文库的富集：与传统的Capture-SELEX相似，首先将DNA随机文库与生物素标记的捕获链进行杂交。然后，该杂交双链通过生物素与链霉亲和素的亲和作用被固定在微球或纯化柱上。随后将DNA文库分别与多个结构相似的靶标共孵育。最后，通过洗脱将与靶标有结合的DNA序列从捕获链上分离，收集的洗脱液经PCR扩增、链分离等步骤后后用于下一轮的筛选（图1A）。
（2）富集文库的测序并生成适体簇：基于作者们之前的工作基础，通过对Illumina MiSeq高通量测序仪的改造，对富集的适配体文库进行高通量测序的同时，还可以实现在流动槽上生成适配体簇（图1B）。
（3）基于链置换的高通量特异性筛选：将带有荧光修饰的单链DNA（置换链）通过碱基配对与流动槽上的适配体簇杂交，使流动槽上产生荧光信号。当向流动槽中加入靶标分子时，靶分子与对应的适配体簇结合，将荧光修饰的置换链从流动槽上置换下来，此时流动槽上相应区域的荧光信号消失或者下降。将获得的适配体簇与置换链（Buffer Cycle）以及不同靶标分子（Target Cycle）交替孵育，通过在不同靶标的循环中荧光强度下降的幅度来评估适配体与靶标结合的特异性（图1C）。
图2 适配体库对五种犬尿酸代谢物的特异性图谱
作为一种概念性的验证，作者们从犬尿氨酸途径（kynurenine pathway, KP）中选择了5种结构相似的分子作为靶标。如图1D所示，这5种靶标分别为：犬尿氨酸（Kyn）、犬尿喹啉酸（KA）、3-羟基犬尿氨酸（3HK）、黄尿酸（XA）和3-羟基邻氨基苯甲酸（3HA）。
接下来，作者们采用该方法分析了280万个适配体簇，并生成了一系列适配体与不同靶标结合的特异性图谱（图2）。作者将每一轮从缓冲液循环（Buffer Cycle）到随后的靶标循环（Target Cycle）中荧光强度变化的百分比进行归一化后转换为Z分数，并通过Z分数来评估适配体与靶标的特异性。如果这些适配体的“特异性比率”（即适配体与靶标的Z分数与最大非靶标的Z分数的比值）大于3，则认为这些适配体对靶标具有特异性。图谱中的每个点代表多个重复中单个适配体序列的平均Z分数。对x与y轴靶标Z分数相等的序列落在每个图中的黑色对角线上，可能与y轴上显示的靶标结合并且对同一靶标具有特异性的序列落入图中的灰色区域。
从图谱显示结果发现，经过筛选得到了对靶标3HK具有特异性的902个候选适配体序列（图2K-O，灰色部分），6个对XA具有特异性的候选序列（图2U-Y，正方形框），一个对KA具有特异性的候选序列（图2F-J，三角形框）。相比之下，对靶标3HA和Kyn仅识别到一些交叉活性的候选序列，也就是说并没有筛选到针对3HA和Kyn具有特异性的适配体序列。
图3 高通量筛选的适配体对靶标结合的特异性分析
随后，作者们从上述三种不同靶标的候选适配体序列中分别挑选了拷贝数最高的序列进行了鉴定和表征。结果显示，3HK-1适配体对3HK靶标的Z值为4.9，而对其它几种结构相似的靶标分子的最大Z值仅为0.29（图3A）；KA-1适配体对KA靶标的Z值为3.6，而对其它结构类似靶标的最大Z值为1.1（图3B）；XA-1适配体对XA靶标的Z值为2.72，而对其它靶标的最大Z值为0.77（图3C）。值得注意的，KA与XA在分子结构仅存在一个羟基的差别，而KA-1以及XA-1依然能够有效区分这两种靶分子。
进一步通过测定适配体与靶标的亲和力，发现三种筛选到的适配体与其靶标分子均具有较高的亲和活性，三种适配体3HK1、KA1以及XA的KD值分别为388.4 nM、3.7 μM和56.5 μM（图4）。并且三种适配体均未显示出对其他结构相似靶标分子的交叉反应活性。
图4 3HK-1、KA-1 和 XA-1 适配体的靶标亲和力和特异性测试
总的来说，这项工作中报道了一种借助高通量测序仪（MiSeq）对富集的适配体文库进行测序并在流动槽上生成适配体簇的方式，这种方式能够在单个实验中有效地发现多个结构相似分子的高特异性适配体，而无需负筛流程。通过该策略，作者们筛选到了针对5种犬尿氨酸代谢物为靶标的3种特异性适配体序列，这些适配体基本上没有表现出脱靶结合，并且可以区分仅相差一个羟基的分子。这种无需负筛的策略极大的简化了核酸适配体筛选的工作流程，将为临床以及研究应用中亲和试剂的鉴定提供了一种有效的工具。
Yoshikawa AM, Wan L, Zheng L, Eisenstein M, Soh HT. A system for multiplexed selection of aptamers with exquisite specificity without counterselection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Mar 22;119(12):e2119945119. doi: 10.1073/pnas.2119945119.
