NAT CHEM丨三环细胞穿透肽可有效地将功能性抗体输送到癌细胞中

有效的靶向细胞内与疾病相关蛋白对于开发新型诊断和治疗药物至关重要。如果能将功能性单克隆抗体递送到细胞内并发挥其活性，将允许利用以前无法成药但与治疗相关的靶标，如细胞内大量存在相互作用的蛋白质。近几年，单克隆抗体胞内递送技术取得了巨大进展，但由于当前载体的毒性或有限的功效，细胞内递送功能性单克隆抗体仍然是一项艰巨的挑战。其中聚阳离子非病毒载体，例如聚合物、脂质颗粒和细胞穿透肽 (CPP)，在过去的三十年中作为一种将单克隆抗体转运到细胞中的手段得到了广泛的研究。典型的CPP Tat已广泛用于细胞内靶向治疗的设计。然而，由于Tat递送具有内体逃逸效率低的缺点，无法适用于大多数细胞内靶向应用。

近日来自牛津大学的Katherine Vallis教授团队在抗体递送领域取得进展，相关文章发表在Nature Chemistry，文中作者利用Tat肽的线性和环状序列设计并合成四种Tat三聚体，这四种三聚体排列在两种不同的四核结构上，并利用共聚焦显微成像在体外对Tat三聚体摄取机制及递送抗体效率进行了研究。研究结果表明，合成Tat三聚体核心结构的几何形状会影响递送效果，并且利用环化Tat替换线性Tat会改变内吞机制。作者确定了最优三聚体结构，并成功将功能性抗体和抗体片段地送到Hela细胞的细胞质及细胞核中。

图1 Tat 三聚体的合成

作者使用线性或环状Tat(cTat)肽的两种不同支架设计并合成了四种Tat三聚体。计算机模拟三聚体的三维结构显示为球棒模型。对Tat三聚体和单体（对照组）在细胞摄取和细胞内分布研究发现，mono-Tat(1μM)不被HeLa或CHO细胞吸收。相反，tri-Tat A在该浓度下显示均匀的细胞溶质摄取和核仁染色。tri-TatB显示在HeLa或CHO细胞中没有细胞溶质摄取或核仁染色的证据，tri-cTatA染色强度低于线性tri-TatA观察到的染色强度，并且转导效率略有降低。与tri-cTatA相比，tri-cTatB在细胞转导方面似乎更有效。这些实验初步确定线性tri-TatA和环状tri-cTatB是最有希望的先导化合物。由于线性和环状三聚体的细胞转导和输送到细胞中的三聚体量不同，作者推测环状三聚体与线性三聚体通过不同的机制进入细胞质。

图2 Hela细胞和CHO细胞中三聚体的摄取

为了更好的了解tri-TatA和tri-cTatB进入胞质溶胶和细胞核的机制，作者两者在与Hela细胞共孵育前15分钟内的摄取动力学。研究发现这两种三聚体在HeLa细胞中显示出不同的摄取模式。tri-TatA与膜的初始强关联，刚开始在胞质溶胶中没有荧光，然后荧光信号从膜扩散到胞质中。相比之下，tri-cTatB与质膜几乎没有关联，而是在胞质中形成囊泡，然后荧光信号从这些囊泡扩散到细胞质中。

图3 Hela细胞摄取肽三聚体的过程

为了研究单个细胞中的发现是否也适用于更大的群体，作者统计了多个细胞不同部位的平均荧光强度变化，结果显示，Tri-Tat A直接跨膜易位，而不是通过内体逃逸进入胞质，而tri-cTatB的细胞进入途径是先形成囊泡样体，然后是经囊泡逃逸进入胞质。作者也评估了tri-TatA和tri-cTatB对细胞膜的完整性和细胞毒性的影响，研究发现Tri-TatA的毒性略高，这与三聚体形成膜孔的观察结果一致。而tri-cTatB对细胞影响不大，tri-cTatB的有利摄取机制和低毒性使作者继续研究了其将生物大分子转运到细胞中的能力。

图4 利用tri-cTat B向heLa细胞中递送抗体和抗体片段

作者首先以免疫球蛋白IgG及其片段为递送对象进行了研究。研究发现tri-cTatB可以将Fab成功递送到50%细胞的细胞质和细胞核中。tri-cTatB也可以实现对完整免疫球蛋白的递送，但递送效率较低，仅20%的细胞被递送成功。这可能是由于抗体的较大尺寸以及观察到抗体在存在tri-cTat B的情况下与Fab片段相比具有更大的聚集趋势。

图5 Tri-cTatB递送功能性抗体和抗体片段

作者接下来研究是否有可能将功能性抗体和抗体片段递送到细胞质和细胞核中。这里作者选择β-肌动蛋白作为靶蛋白。为了清楚地识别肌动蛋白，作者先用与肌动蛋白融合的RFP（肌动蛋白-RFP）转染HeLa细胞30分钟，再将与β-肌动蛋白抗体（小鼠 IgG2b）或与AF647结合的β-肌动蛋白Fab片段（小鼠）加tri-cTat B与细胞共孵育。图5a，b显示了β-肌动蛋白与IgG/Fab片段共定位。为了客观量化β-肌动蛋白应力纤维和IgG/Fab片段（白色箭头）之间的共定位，作者在选定的ROI中使用了共定位阈值算法。这些结果表明，β-肌动蛋白Fab和IgG抗体保留了它们在细胞质中结合肌动蛋白应力纤维的能力。

图6 邻位连接实验

作者继续研究tri-cTatB是否可将功能性抗体递送至细胞核。HeLa细胞用组蛋白-RFP融合蛋白转染，然后与tri-cTatB和抗RFP IgG共孵育。结果显示抗体进入细胞核并与RFP共定位（白色箭头）。这些结果验证了共定位实验的结果，并表明使用tri-cTatB递送到细胞质和细胞核中的抗体和抗体片段保留了它们结合靶蛋白的能力。

总之，作者利用tat肽的线性和环状序列设计并合成四种Tat三聚体，这些三聚体排列在两种不同的四核结构上，作者研究了肽三聚体进入细胞的能力及机制。结果表明合成核心结构的几何形状会影响递送效果，并且利用环化变体替换线性tat会改变其进入细胞的机制。作者确定了最优肽三聚体tri-TatB并展示了将功能性抗体和抗体片段递送到Hela细胞中。

Tri-cTatB是一种高效的非病毒递送剂，可将生物大分子物质快速、无毒地转运到细胞中，可以作为一种有效的递送剂来解决靶向细胞内治疗靶点的挑战。此外，这里报道的结构-活性见解将有助于开发具有定制机械特性的新型CPP多聚体。

Tietz O, Cortezon-Tamarit F, Chalk R, Able S, Vallis KA. Tricyclic cell-penetrating peptides for efficient delivery of functional antibodies into cancer cells. Nat Chem. 2022 Mar;14(3):284-293. doi: 10.1038/s41557-021-00866-0.