BioRxiv丨Multi-micron crisscross structures from combinatorially assembled DNA-origami slats
今天分享的文章是2022年1月发表在预印本在线期刊bioRxiv的Multi-micron crisscross structures from combinatorially assembled DNA-origami slats。
该工作来自哈佛大学,通讯作者是William Shih教授。
在这一工作中,作者利用十字纵横组装(Crisscross Polymerization)策略,以条形DNA折纸结构(DNA-Origami Slats)为单体,成功设计组装了分子量达五十亿道尔顿(Gigadalton, GDa)的有限DNA结构,且组成该结构的千余个slats都具有唯一性。
在结构DNA纳米技术领域,DNA折纸术(DNA Origami)可以实现任意二维、三维的纳米结构组装。然而受限于M13 DNA的长度,单个DNA折纸结构的尺寸只能达到五百万道尔顿(Megadalton, MDa)。DNA砖块策略(DNA Bricks/Tiles)突破了M13长度限制,可以实现组装分子量达0.5 GDa的结构,由于组装这一结构的近30000个bricks全部需要化学合成,这是一笔极高的成本,很大程度上限制了DNA bricks策略组装大型结构及其下游应用。并且由于DNA bricks策略是一种自发的组装方式,因此目标结构的产率往往不尽人意且难以纯化。除上述两种经典的DNA结构组装方式,近年来越来越多的工作采用分层级组装策略来获得大尺寸DNA结构。例如 Shih课题组通过将多个DNA折纸单体堆叠组装,得到了分子量约100MDa,直径90 nm,高250 nm的空心桶形DNA结构。再比如来自加州理工大学的Lulu Qian课题组,通过拼接64块矩形DNA折纸单体组装得到微米尺寸的DNA折纸阵列。但由于该方法需要分步组装,每一步伴随着难以避免的副产物、结构聚集,使得目标结构的最终产率低,且仅适用于最多几十个DNA折纸单体的组装。
此前,本文作者开发了Crisscross polymerization策略,用于以单链DNA(ssDNA)为单体的DNA结构成核组装。基于此,作者在此提出以6螺旋(6HB)或12螺旋(12HB)的DNA-origami slats为单体的Crisscross polymerization方法用于实现GDa分子量的DNA结构组装,且组装的发生依赖于种子(seed,一个DNA折纸结构)结构的存在,最终产物量受种子的量控制(图1A)。
在作者提出的方法中,6HB slats长450 nm,沿长分布有32个结合位点,彼此间距约14 nm;12HB slats长225 nm,沿长分布有16个结合位点。所有的结合位点上有经过优化后采用的 7 nt长度的ssDNA用于slats间的连接(图1B i)。种子结构含有16列螺旋,每列螺旋上分布有5个“插座”位点,能结合参与成核生长的slats上的10 nt “插头”(图1B ii)。因此,当混合体系中存在种子时,参与成核的slats会优先与种子结合,随之形成成列的结合位点,从而使后续生长在热力学上可行;而当体系中不存在种子时,slats之间仅有1个7 nt的结合点,难以形成稳定的结合而无法继续组装。
对于slats上7nt结合位点的序列,作者筛选出了32个能量相等的序列,结合32个结合位点处staples的序列,合成了包含2048条staples的文库(32 x 32 x 2)用于slats 的结合位点部分组装。理论上,利用该文库能够制备3232(即~1048)种不同的6HB(或3216种12HB)(图1E)。基于上述策略,作者成功构建了多种分子量达MDa(最大分子量约为5.4 GDa)的有限结构,且组成这些结构的sltas具有唯一性和可寻址性(图1C),同时也成功组装了由超过10000个slats组成的周期性结构。
图1. 条形DNA折纸的十字纵横组装策略概览
图2展示了有限结构的TEM图像。经过高分辨率的TEM图像统计,作者发现等温过夜组装后,有约90%的slats单体参与了结构组装,并且在后续两天的室温放置后,这一百分比提高到97%(图2C)。
图2. MDa分子量的有限DNA结构的TEM图像。组成这些结构的每一个slat单体都具有唯一性和可寻址性
与基于ssDNA的十字纵横组装一样,DNA-origami slats同样可以用于一维或二维的周期性结构生长。图3A, B展示了几种一维生长策略和它们的TEM图像。图3C展示了一种二维生长策略和对应的TEM结果。
图3. 基于6HB一维、二维周期性生长得到的带状结构和片状结构
得益于有限十字纵横组装的可寻址性。作者构建了一块尺寸为~2.0 µm × ~1.8 µm DNA画板,并通过在画板上特定位点设置DNA立方体,“绘制”了多种不同的图像,图4A展示了拼图、笑脸图案,以及Wyss Institute和哈佛大学工程学院的标识。该画板具有16128个可寻址的结点用于“绘制”,每个结点间距为14 nm。图4B展示用DNA立方体修饰后的周期性结构,可以直观地看到其表面周期性分布的DNA立方体。此外,作者用DNA-PAINT表征了周期性生长结构(图4C)
图4. 有限和周期性十字纵横结构用作可寻址的DNA画板
十字纵横生长严格依赖于种子。如图5A, B所示,在没有种子存在时,无论有限结构还是周期性结构都无法生长。和DNA折纸的得率依赖于M13的浓度类似,十字纵横组装的产物浓度也依赖于种子浓度(图5C)。此外,作者也对十字纵横生长的条件参数,包括温度、slats浓度、镁离子浓度和等温反应时长进行了探究和优化(图5D, E)。
图5. Crisscross Polymerization的生长参数优化
更大的结构能为更复杂的功能提供实现的平台。这一工作在实现MDa分子量的有限DNA结构组装的同时,确保了组装单体的唯一性和可寻址性,且相较于DNA bricks策略,该方法极大地降低了组装成本,为开发基于Megastructures的下游应用开发提供了可能和便利。
Multi-micron crisscross structures from combinatorially assembled DNA-origami slats
Christopher M. Wintersinger, Dionis Minev, Anastasia Ershova, Hiroshi M. Sasaki, Gokul Gowri, Jonathan F. Berengut, F. Eduardo Corea-Dilbert, Peng Yin, William M. Shih
bioRxiv 2022.01.06.475243; doi: https://doi.org/10.1101/2022.01.06.475243