NAT COMMUN 丨细胞中microRNA介导的基因沉默的单分子成像

今天介绍的文献是上个月发表的Nature Communication上Single-molecule imaging of microRNA-mediated gene silencing in cells。

作者介绍：

通讯作者Singer教授是纽约阿尔伯特·爱因斯坦医学院的解剖学和结构生物学系教授。他的研究方向是RNA的细胞生物学过程。他的实验室开发了在固定细胞和活细胞通过荧光探针标记RNA的方法，并开发了配套的显微镜技术和图像分析算法，以同时可视化和量化许多mRNA。

背景介绍

MicroRNAs (miRNAs)是约22nt的小非编码RNA，大多数真核miRNA的功能是在转录后调节基因表达。其调节作用可分成三类：翻译抑制、mRNA降解和mRNA切割，翻译抑制。当mRNA的正常转录受到抑制时，可能引起mRNA的脱帽脱尾，然后引起mRNA从5’端或者3’端开始降解。这可能是动物细胞中miRNA造成mRNA水平降低的主要方式。

现有的miRNAs的功能主要是通过集成方法来监测的，例如荧光素酶分析、核糖体分析和RNA测序，这些方法都是在细胞外进行测量的。但细胞内单个分子的行为及其时空调控仍是未知的。在这项研究中，研究人员开发了一系列的单分子方法，实现了成像miRNA-mediated基因沉默的每个步骤:细胞内RISC结合、翻译抑制和mRNA降解。

这篇研究用到的方法是SINAPS（新生肽单分子成像），该技术利用SunTag技术进行信号放大和将auxin-induced degron (AID，生长素诱导的蛋白降解子)融合到报告基因的C端来去除完整的蛋白，解决了对特定翻译位点(TLS)的可视化需要克服的两大障碍：新生链的微弱信号和翻译结束后带有标记的蛋白质而产生的背景。

结果介绍

单分子分辨率的mRNA降解可视化

研究人员试图开发一种方法来可视化miRNA介导的mRNA降解。使用的细胞是广泛用于RNA成像的人类U2OS细胞(人骨肉瘤细胞）中，选择的miR-21是U2OS细胞中最丰富的miRNA。在这个报告系统中，两个不同的mRNA在双向启动子的控制下表达：荧光素酶(Fluc)标记的 mRNA代表内部控制。带有miR-21位点的SunTag mRNA被用来监测miRNA介导的mRNA衰减，而带有（miR-21）突变位点的SunTag mRNA被用作阴性对照。通过单分子荧光原位杂交(smFISH)检测报告mRNA，以单分子敏感性将其可视化，作为内参的mRNA链带有红色荧光，目标mRNA链带有绿色荧光。进行了三维(3D)荧光成像，然后使用FISH-quant算法进行了3D单分子检测实现定量分析，通过目标链/内参链的比值进行比较，可以看到在当SunTag mRNA具有miR-21位点时，mRNA的数量明显减少。证明了当SunTag mRNA具有miR-21位点时，mRNA稳定性降低。虽然常规集成方法可以从大量细胞中收集mRNA，但该方法可以逐个细胞分析mRNA的表达水平。此外，与标准方法不同，该方法可以计算mRNA的绝对数量，从而允许miRNA功能的绝对量化。

单分子分辨率的miRNAs翻译抑制的可视化研究

其次，研究人员开发了一种方法来可视化miRNA介导的翻译抑制。构建了再现miR-21翻译抑制的报告mRNA，类似前面的，有SunTag序列和降解子序列和miR-21位点序列。由于miRNA也会触发mRNA降解会导致了不可忽视的分析mRNA数量的减少。在UTR上添加了抗降解序列A114-N40，以保护mRNA不受去腺苷酸化的影响。报告mRNA和翻译分别通过单分子分辨率的单分子荧光原位杂交进行可视化。表达无miR-21位点mRNA的U2OS细胞在mRNA上显示明亮的SunTag信号，U2OS细胞表达具有miR-21位点的报告mRNA，在mRNA上没有显示明亮的SunTag信号。定量分析证实了miR-21降低了翻译效率。与此一致的是，在使用嘌呤霉素(一种翻译抑制剂)治疗后，mRNA上的SunTag信号几乎完全消失。这些结果表明，该方法可以用单分子分辨率来可视化miRNA-mediated翻译抑制。

常用的大量收集mRNA进行分析的方法，可以监测miRNAs的翻译抑制。然而，即使这些方法检测到50%的抑制效率，它们也不能解释miRNAs如何完成细胞内50%的沉默：翻译mRNA的数量可能减少到50%，或者翻译mRNA上的核糖体数量可能减少到50%，还是两者将结合。利用单分子成像方法，研究人员解决了这个问题：在mRNA和SunTag之间进行了3D共定位分析。随后，根据3D距离决定的与SunTag的共定位，将所有mRNA分类为“未翻译”或“翻译”mRNA。该分析显示，miRNAs减少了细胞内翻译mRNA的数量。在SINAPS实验中，暗淡的不与mRNA共定位的SunTag信号代表核糖体释放的（还没有来得及被降解）单个SunTag多肽。另一方面，明亮的SunTag信号由多个核糖体翻译的多个SunTag多肽组成。利用游离SunTag和mRNA上SunTag的荧光强度，可以粗略估计翻译mRNA上核糖体的数量（越亮的结合的核糖体越多）。该分析显示，miRNAs还减少了翻译后的mRNAs上核糖体的数量。

单分子分辨率RISC结合

第三，研究人员建立一种以单分子分辨率成像可视化RISC结合的方法。使用了含有八个miR-21位点的翻译抑制报告mRNA，RISC通过带有抗AGO抗体的进行免疫荧光成像，而报告mRNA通过单分子分辨率的smFISH成像。尽管人类中存在四种AGO蛋白，但AGO2主要在U2OS细胞35中表达，因此我们在本研究中重点关注AGO2。除了由于miR-21的结合报告mRNA的RISC结合外，其他的非特异性结合越少越少。因此，研究人员地报告mRNAs中删除了前30个最丰富的miRNAs中的11个潜在miRNA位点。表达具有miR-21位点的报告基因mRNA的U2OS细胞在mRNA上显示AGO信号。相比之下，具有突变位点的报告基因与AGO没有共定位。通过批量分析、单细胞分析和单分子分析，定量证实了miR-21介导的RISC结合。接着探索了该方法是否能检测单个RISC分子，结果显示有差异，但效果并不佳。

单个mRNA、翻译和risc结合的同时可视化

    接下来在单mRNA水平上探索了这些步骤之间的关系。我们使用携带miR-21位点的报告mRNA，同时观察单个mRNA、翻译和RISC结合。

    基于3D共定位分析，所有mRNA被分为4类: (1) RISC阴性的非翻译mRNA， (2)RISC阴性的翻译mRNA，(3)RISC阳性的非翻译mRNA，(4)RISC阳性的翻译mRNA。值得注意的是，大量具有miR-21位点的报告mRNA被归类为RISC阴性非翻译mRNA。推测这一类可能包括已经被沉默并从RISC中释放出来的mRNA。

    当使用分类数据进行单细胞分析时，RISC-binding efficiency和translational efficiency呈现出负相关的趋势(图4d)，RISC结合的越多，翻译效率越慢，这与RISC的功能是一致的。出乎意料的是，当在单分子水平上分析每一类mRNA时，发现与未翻译的mRNA相比，翻译的mRNA更多于被RISC结合。推测RISC需要相对较长的时间来抑制，如果RISC立即抑制翻译，大多数RISC阳性的mRNAs应该是未翻译的mRNAs。

通过单个mRNA成像对RISC结合、翻译抑制和mRNA衰变进行时空分析

   接下来探索了miRNA介导的基因沉默的时间过程。发现，RISC在mRNA从细胞核运输到细胞质后立即与之结合，随后在30分钟内发生翻译抑制。与翻译抑制不同，在脉冲后30分钟未观察到mRNA降解而是60min。

总结：

该研究新发现了以下两点：

(1)RISC在mRNA从细胞核运输到细胞质后立即与之结合;这可能是因为当翻译不完全活跃时，RISC与mRNA结合，并阻止它们被激活。这种沉默方式可能比翻译进行后更有效。

(2)RISC优先选择翻译mRNA而非翻译mRNA;这可能是英文如果RISC以同样的效率识别翻译后的mRNA和未翻译的mrna，这将是对RISC的浪费，因为RISC不需要与未翻译的mrna结合。因此，推测这种偏好将有助于节约使用RISC，其数量在细胞内是有限的。

RISC优先与翻译后的mRNA结合的机制尚未解释并应在未来进行继续研究。

Kobayashi, H., Singer, R.H. Single-molecule imaging of microRNA-mediated gene silencing in cells. Nat Commun 13, 1435 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29046-5