NUCLEIC ACIDS RES丨通过荧光激活液滴的方式高通量筛选无细胞核糖开关

大家好，今天分享的文献是2022年3月发表在Nucleic Acids Research上的“通过荧光激活液滴的方式高通量筛选无细胞核糖开关”。

有关作者：

作者是冲绳科学技术大学院大学核酸化学工学部的横林洋平教授，课题组的主要研究方向是高通量测序在分析和工程核酸酶中的应用；核糖开关在哺乳动物细胞、病毒、细菌、人工细胞中的开发与应用；DNA编程的自组装等。

研究背景：

• CFPS

在新兴的无细胞合成生物学领域，研究人员的目标是在不使用活细胞的情况下构建模拟或受生物系统启发的复杂生物分子系统。无细胞系统受到的实验限制更少，因此可以更好地控制实验参数。其中无细胞蛋白质合成 (CFPS) 系统是一种简单、快速且灵敏的工具，它没有膜结合屏障，但包含合成所需蛋白质所需的所有必需底物、生物分子和机器。它已被用于遗传密码的扩展、病毒的组装以及用于生产有毒和复杂蛋白质的代谢工程。目前常见的无细胞系统分为两种：基于细胞裂解物（即 S30 提取物）或重构的生物分子成分（即 PURE 系统）。与活细胞一样，基于 CFPS 系统的无细胞系统需要基因元件和调控元件，例如化学响应基因开关等来实现复杂的功能。然而，这些调控元件往往来自于活细胞，或者由活细胞中进行改造和优化。因此，它们可能无法在无细胞环境中发挥最佳功能，并且它们的性能和可用性受到活细胞的生物学限制。虽然已经有许多针对无细胞系统的核糖开关通过体外SELEX被发现，或者针对天然存在的核糖开关进行改造，但是仍然缺乏用于直接在 CFPS 系统中优化无细胞核糖开关的高通量筛选方法。

• Riboswitch

作为使无细胞系统能够响应化学信号的替代策略，核糖开关已引起越来越多的关注。核糖开关主要存在于细菌中，是位于 mRNA 的非翻译区 (UTR) 的调节 RNA 序列，可以在没有蛋白质作为转录因子的情况下响应特定的化学信号上调或下调基因表达。一个典型的核糖开关包含一个适体结构域，可特异性识别配体分子，以及一个表达平台，该平台在适体-配体相互作用时介导结构变化，从而调节蛋白质表达。

因为已知识别多种分子的RNA适体可以通过体外获得选择（SELEX），研究人员开发了合成核糖开关，使用在实验室中选择的适体响应天然和非天然化学信号。许多合成核糖开关已被设计用于在细菌和哺乳动物细胞以及其他细胞和生物体中发挥作用。核糖开关作为嵌在表达受调控基因的同一mRNA 中的顺式调控元件，与基于转录因子的开关相比，核糖开关的脱靶效应更少，反应更快。没有蛋白质成分，核糖开关对翻译机器的负担最小。此外，无细胞平台可能会规避一些限制许多体外实验的生物学限制，从而更好地发挥出优势。

整体设计：

                           图1，无细胞核糖开关的高通量筛选策略概述

首先，编码核糖开关变体的 DNA 模板按照先前报道的称为 BEAMing系统中在磁性微珠上进行克隆扩增（D）。然后，将磁珠单独封装在含有 CFPS 系统 (PURE frex ) 的油包水乳液液滴中（图F）。单个液滴（每个液滴包含一个核糖开关变体）根据核糖开关输出表达荧光报告基因（1G，H）。对液滴进行分类以恢复显示所需输出（开或关）的核糖开关编码模板（图I，J）。重复这些 ON 和 OFF 排序循环以丰富原始库中的功能性核糖开关。作者首次开发了基于微流控芯片中油包水液滴分选的无细胞核糖开关的高通量筛选策略，开发了基于两种适配体的三种类型的核糖开关并验证了无细胞条件下优化的核糖开关可用于sender and receiver之间的化学通讯。

结果与讨论：

1. 筛选模型验证：

图2. ON-和OFF-droplets的模拟筛选。

为了验证筛选策略，作者使用两个模拟 ON 和 OFF 核糖开关输出的 DNA 模板设计并执行了模拟实验。ON 模板包含一个规范的 RBS 序列，可以稳定地翻译编码的基因 (P T7 -RBS-GFP11)，而 OFF 模板包含一个弱化的 RBS 序列，翻译效率低 (P T7 -wRBS-GFP11)。DNA 混合物通过 BEAMing 在磁珠上进行克隆扩增，并用于制备含有单个磁珠的液滴，然后通过荧光显微镜对分类的液滴进行成像。模板 DNA 也通过 PCR 从分选的液滴中回收，并通过 PCR 产物的限制性消化估计两种物种（ON 和 OFF）的相对丰度。分选前后液滴的荧光图像显示，ON 和 OFF 液滴分别平均富集 48 倍和 38 倍，有效去除了空液滴（图2C）。使用从分选磁珠中分离出来的磁珠，通过 PCR 产物的限制性消化分析估计 ON 和 OFF DNA 模板的富集（图2D），证实使用我们的液滴分选方法可以丰富 CFPS 系统中的 DNA 模板以进行 ON 或 OFF 基因表达。

2，组胺 ON-核糖开关

图3. 组胺响应的核糖开关文库 HA-C1g (N6)

作者设计了一个基于组胺适体 A1-949 ( 38 ) 的新核糖开关文库，该文库融合到一个接头序列，旨在隔离跨越 RBS 和起始密码子的区域（抑制性茎环，图3A中的 ISL ）导致抑制蛋白质表达。适体直接上游的四到六个核苷酸被随机化，期望当适体通过竞争和破坏 ISL 结构而结合组胺时，一些变体将激活翻译。四轮分选交替循环在 5 mM 组胺存在的情况下进行两轮 ON-sorting 和在没有组胺的情况下进行 OFF-sorting（图3B）。最初的文库在作为混合物进行分析时对组胺没有反应，但经过四轮分选后的核糖开关文库在组胺存在下显示出 10.8 倍的激活，这表明连续的分选富集了组胺 ON 核糖开关。

图4. 组胺 ON 开关的表征

对富集变体的检查证实，这些核糖开关最有可能通过在适体基部形成竞争性茎 (CS) 结构来破坏 ISL 结构来发挥作用（图4A）。所有前 19 个变体在适体附近的四个核苷酸处共享共有序列 GYGU（Y = C 或 U），它们可能形成在适体-配体结合时稳定的 CS 结构（图4A）。与该机制一致，在 HA-C1g-19 中使 CS 不稳定的随机区域内引入错配导致有或没有组胺的低基因表达（HA-C1g-19/OFF，图4B，C）。相反，通过增加 CS 长度来稳定 CS 会导致在没有组胺的情况下更高的表达水平（HA-C1g-19/ON，图4B，C）。同理作者筛选了组胺OFF型的核糖开关以及环丙沙星 ON-核糖开关用于CFPS。

图5. 液滴之间通过组胺进行化学通讯

无细胞核糖开关使无细胞系统能够检测来自环境（接收器）的化学信号，并通过调节蛋白质表达做出反应。如果另一个无细胞系统可以合成化学信号（发送器）并将其释放到环境中，那么这两个系统可以通过化学信号进行通信。

在这项工作中，作者尝试使用组胺作为化学信号来介导液滴之间的通信。发送器液滴包含编码组氨酸脱羧酶 (HDC) 的 DNA 模板，该酶使用磷酸吡哆醛 (PLP) 作为辅因子从 L-组氨酸中产生组胺。接收器液滴包含一个在组胺 ON-核糖开关 (HA-C1g-19) 控制下编码 GFP11 的 DNA 模板和另一个组成性表达 GFP1-10 片段的 DNA 模板 (图5A )。当发射器和接收器液滴混合并在显微镜下观察时，被含有 PLP 的发射器液滴包围的接收器液滴（图5B，F) 与没有 PLP 的发送液滴包围的荧光相比，明显显示出更高的 GFP 荧光（图5C，F）。当接收器液滴与发送器液滴过量混合时，观察到接收器液滴中 GFP 表达的空间梯度，靠近发送器的液滴显示出更强的 GFP 荧光（图5E，G）。仅包含组胺的发送器液滴确认接收器信号是由组胺触发的，而不是 PLP 或 L-组氨酸（图5D）。

总结：

1， 通过微流控实现了体外的高通量无细胞核糖开关筛选，并且具有一定的通用性，可以针对不同靶标/筛选出ON/OFF型核糖开关。

2， 分子信标的运用，作为 mRNA 转录的报告器来避免在 OFF-sorting 循环中对空液滴进行分类，使得筛选更为有效。

3，针对无细胞体系的核糖开关筛选能够更好地适应非生物体系。

Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 6, 8 April 2022, Pages 3535–3550, https://doi.org/10.1093/nar/gkac152