JACS丨用于抗体检测的可编程无细胞转录开关

大家好，今天给大家分享的文献是最近发布在JACS上意大利罗马大学Francesco Ricci课题组的文章，题目是《用于抗体检测的可编程无细胞转录开关》。Ricci课题组主要研究方向是纳米分子开关、药物释放纳米机器以及超分子化学。

这份研究主要是基于该课题组在2020年发表在Nature communication的工作，在2020年的这份工作中，作者主要设计了这样一个抗体感受器，主要有两条功能性互补DNA构成，当抗体进入该体系后将介导这两条DNA的互补，从而诱发下一步的反应。

图1 可编程抗体感应转录元件反应原理

在这一份JACS的工作中，作者主要探索抗体感受器能否被应用于检测血液中的抗体，作者做了一个这样的设计，这个设计的第一个模块是转录开关，一种由两条互补DNA 链组成的构象转换发夹 DNA（图 1A）。 这种转录开关由三个主要结构域组成：编码开关 RNA 输出的双链 (ds) 部分（红色结构域）、T7 RNA 聚合酶 (RNAP)，启动子结构域（蓝色）和一个在发夹的茎环结构中编码的转换结构域。 转录开关的输出是发光的 RNA 适体，例如芒果或菠菜适体。该开关的设计使得在没有特异性靶抗体的情况下，输出 RNA 适体的转录效率低下，由于启动子域的不完整性。

该平台的第二个模块是抗体反应模块，由两条抗原结合的 DNA 链组成。这些链经过设计，能让互补部分（黑色，图 1A）的杂交导致形成双分子功能复合物（输入），该复合物能够通过toehold介导的链置换反应诱导转录开关的构象变化，从而形成一个完整的启动子结构域，进而被 T7-RNAP 识别并诱导有效转录（图 1A，右）。另外，抗原结合的DNA 链的互补部分被设计成在使用的稀释浓度下形成不稳定的复合物。只有在目标抗体与这两条链二价结合时，才能实现共定位诱导的功能复合物（输入）形成，最终触发与转录开关的反应（图 1B）。这些模块可以与市售的无细胞转录试剂盒（包含 T7-RNAP、核苷酸和其他成分）一起使用，在适配体结合染料存在的情况下产生的荧光信号将告知目标抗体的存在和浓度（图 1B）。

图2 共定位介导的转录开关设计

接下来我们看一下这个转录开关的具体设计。作者首先优化转录开关模块的热力学。作者首先设计了一组转录开关，它们具有相同的 17 nt T7-RNAP 启动子序列和相同的发夹结构，具有 9 nt 环和 6 nt 茎（图 2A）。作者设计的变体具有隐藏在茎环结构中的可变长度的启动子序列（从 1 到 17 nt）（图 2B 和在图 2C 中，显示了三个变体作为示例）。作者这里首先使用了Mango 适体，Mango与噻唑橙 (TO-1) 衍生物结合后荧光信号增加。作者比较了存在和不存在线性单链DNA输入链情况下，mango适配体的信号。这里测试的输入链是一条模拟链，该输入链将在二价抗体与抗体响应模块结合时形成（图 2D）。该链包含一个 12 nt 的toehold部分和一个 21 nt 的侵入域。当没有输入链的时候，启动子结构域暴露的长度小于 12 nt。增加暴露启动子的长度至14 nt 时转录活性持续增加到平稳。相反，在输入链存在的情况下，暴露启动子长度超过 8 nt 的开关都观察到有效的转录（图 2E，F），也就是说暴露启动子在8-12是最合适的。作者发现在输入链存在的情况下，10nt 暴露的启动子能使mango适体转录的增加最高（图 2E，F）。

有了这个优化的转录开关，作者开始探索split DNA是否能转录。作者在转录链体系内加入两条Split DNA链，这两条 DNA 链之间的 6 nt 互补部分（图 2G），就是基于之前Nature Communication的DNA链。为了证明原理可行性，作者首先加入未修饰抗原的split DNA。正如预期的那样，在低浓度稀释条件下（<30 nM），两条链不会导致mango的转录，并且仅在饱和浓度（>100 nM）下，信号有所增加（图 2H）。然后，我们采用二价 DNA 链充当抗体模拟物（Ab-模拟物），这条链和两条split DNA形成stem结构（图 2G）。这种 Ab 模拟链产生发光的 RNA 适体，其效率类似于完整的单分子输入链，甚至在低浓度30nM条件下，也能诱导Mango的转录。

图3 使用可编程抗体感应转录开关

接下来作者开始探索抗体是否能激活这个感受器。作者首先以地高辛（Dig）用作识别元件（即抗原），将Dig修饰在split DNA两端（图 3A）。首先，作者观察到只有在抗 Dig 抗体 (100 nM) 存在的情况下才能实现有效的mango转录，并且输出信号在反应 120 分钟后开始趋于平稳（图 3B）。正如预期的那样，在抗 Dig 抗体存在下转录反应结束时获得的荧光光谱显示，当与 Mango 适配体结合时，TO-1 染料的发射信号特征增加（图 3C）。然后作者发现该体系在10% FBS也有极好的敏感性，并补充了浓度增加的抗 Dig 抗体（图 3D ）。该平台也是高度特异性的，在存在非特异性抗体（100 nM）或存在 Anti-Dig Fab 片段（单价，不能诱导两条抗原结合链）（图 3E）。接下来作者测试这个感受器是否能测试其他抗体，作者将识别元件换成二硝基苯酚，测试抗DNP抗体是否能被感受器识别（图 3F），结果显示敏感性和特异性与抗 Dig 抗体观察到的相似（图 3G-J）。另外，作者还探索这个体系是否能同时检测两种抗体，于是将上面测试的两个体系mix在一起。结果显示仅在两种抗体存在的情况下观察到两种染料的高荧光信号（图 S5）。

为了进一步探索除了感受器以外的应用，作者设计了新的体系，测试能否由抗体调控下游靶蛋白的活性（图 S6）。作者设计了一种新的 Anti-Dig 转录开关，在存在靶抗体的情况下，它会转录一种能抑制 SP6 RNA 聚合酶活性的 RNA 适体。在没有 Anti-Dig 抗体的情况下，SP6- RNAP 是完全活跃的，并从含有 SP6 启动子结构域的第二个 DNA 模板诱导发光的 Mango RNA 适体转录（图 S6）。在存在特异性抗 Dig 抗体的情况下，转录的适体抑制 SP6-RNAP 的活性，能够观察到mango适体信号的强烈降低（图 S6）。

图4 用于HA抗体检测的模块化转录开关设计

最后作者想探索这个抗体检测系统是否可以用于临床。考虑到感染后产生的抗体通常是针对蛋白质表位或肽产生的。 由于肽（和整个蛋白质）与 DNA 链的结合具有挑战性且成本高昂。因此作者设计了一个模块化版本的抗体响应转录开关，可以很容易地适应使用肽作为识别元件。作者重新设计了两条抗体响应模块链，使其包含一个 17 nt 长的粘性末端，该域可以与肽-PNA 链杂交（这降低了合成难度）（图 4A）。通过这种模块化方法，作者将人流感血凝素（HA蛋白）中能被HA抗体识别的9个氨基酸短肽作为抗原表位与PNA合成在一起（图 4A）。经测试，该体系灵敏度在纳摩尔范围内（KD =5±1nMin 缓冲液，KD =4.1±0.2 nM，在 10% 血清中）（图 4B）。作者通过确定四种代表性抗 HA 浓度水平（2、7、17 和 25 nM，每个浓度 n = 10）的加标血清样品的回收率来评估所提出方法的准确性（图 4C）。结果表明回收率在 77%（在 2 nM Anti-HA 浓度下，CI 95% = 1.4-1.7 nM）和 107%（在 7 nM Anti-HA 浓度下，CI 95% = 6.3-8.1 nM）之间具有良好的准确性（图 4C 和图 S10）。

1. Programmable Cell-Free Transcriptional Switches for Antibody Detection

   Aitor Patino Diaz, Sara Bracaglia, Simona Ranallo, Tania Patino, Alessandro Porchetta, and Francesco Ricci

   Journal of the American Chemical Society 2022 144 (13), 5820-5826

   DOI: 10.1021/jacs.1c11706