JACS丨基于链置换反应的变色荧光条码可实现简单的多重标记

   大家好，今天与大家分享一篇发表在JACS上的文章《Color-Changing Fluorescent Barcode Based on Strand Displacement Reaction Enables Simple Multiplexed Labeling》，通讯作者是名古屋大学的Hiromu Kashida教授。Hiromu Kashida教授课题组主要从事寡核苷酸探针及寡核苷酸类药物等方向的研究。

   荧光成像技术能够原位呈现出靶标分子的状态，有助于揭示各种生命现象; 然而，荧光基团的光谱重叠，限制了荧光成像技术的通量。利用DNA卓越的可编程性，科学家们已开发出多种策略，来解决这一难题。然而，这些策略往往伴随着复杂的DNA序列设计，使得高通量荧光成像技术的广泛应用仍然具有挑战性。本文中，作者报道了一种基于链置换反应的变色荧光条形码技术 (Color-Changing Fluorescent Barcode, CCFB)，只需要设计简单的线性核酸，可同时检测多个靶标分子，操作简便，且易于拓展 (图1)。

图1. CCFB技术示意图。

图2. 溶液中CCFB系统荧光的顺序变化。

   CCFB复合物是由荧光基团修饰的人工碱基D-αTNA链及其反向互补模板链组成 (统称为F链) (图1c)。D-αTNA链能够与互补的D-αTNA链之间能形成稳定的双链结构，但无法与互补的DNA或RNA链稳定杂交，因此可极大减少细胞内核酸造成的背景干扰。每条TNA荧光链的两端分别修饰了一个荧光基团和一个猝灭基团，再通过反向互补序列的作用，就能够形成一条线性双链DNA (图1a)。并且，除了末端序列上修饰的荧光基团外，其它链上的荧光基团均被相邻链上的猝灭基团猝灭 (图1)。按顺序加入猝灭基团修饰的链置换序列 (Q链) 后，则能够顺序置换出CCFB末端的序列，从而形成荧光条形码 (图1)。由于相同的一套链置换序列可以解码出不同的荧光条形码，所以CCFB技术不需要复杂的纳米结构设计和大量的寡核苷酸。而Q链上标记的猝灭基团也使得被置换下来的F链上的荧光基团保持猝灭状态，从而避免了大量的洗涤工作。CCFB技术可检测到的靶标分子的数量与CCFB复合物中荧光序列的数量呈指数关系：当使用M种荧光团 (由于光谱重叠，限制为5种)，N条荧光序列时，荧光变化的次数为N - 1，可用于检测M^N个靶标分子，只需要M * N + 3N - 4条序列。

图3. 单一CCFB荧光条形码修饰微球上的荧光顺序变化。

   作者首先构建了一个由荧光TNF链F1、F3、F5及模板链F2、F4组成的CCFB复合物，并在溶液中对CCFB技术进行验证 (图2a)。如图2b所示，按顺序加入Q链后，相应的荧光能够顺序激活及猝灭。随后，通过生物素-链霉亲和素系统，作者还将同样的条形码偶联到了聚苯乙烯微球上，并在荧光显微镜下，观察到了三种荧光条形码 (Cy5→Cy3→FAM、Cy3→Cy5→FAM及FAM→Cy5→Cy3) 中荧光的顺序激活及猝灭 (图3)。此外，作者进一步利用CCFB技术，构建了9种不同的荧光条形码，分别固定到不同的聚苯乙烯微球上，将这些微球混合后置于荧光显微镜下观察，能够清晰的看到不同条形码标记的微球(图4)。

图4. 9种不同CCFB荧光条形码修饰微球混合物中的荧光顺序变化。

   基于上述实验结果，作者使用CCFB技术对哺乳动物细胞内的蛋白进行了荧光成像。作者在模板链F4上修饰了靶向F-Actin的鬼闭环肽，然后与荧光链F1、F3、F5及模板链F2组成了CCFB系统。通过顺序加入置换链Q，实现了对F-Actin的Cy5→Cy3→FAM荧光条形码成像 (图5)。最后，通过偶联了荧光条形码的抗体，作者对细胞内三种不同的蛋白同时进行了成像 (图6)。

图5. 修饰了鬼闭环肽的CCFB荧光条形码对细胞内F-Actin蛋白的荧光成像。

图6. 修饰有不同CCFB荧光条形码的三种抗体，对细胞内相应蛋白的单一及同时成像。

   CCFB技术通过连续的链置换反应构建了荧光条形码系统，操作简便、省时，且无需复杂的序列设计，使得该方法具有较高的可扩展性，但也存在无信号放大及背景高等可进一步改进的地方。