NUCLEIC ACIDS RES丨基于杂交的原位测序技术用于人脑和鼠脑组织的空间转录组分析
大家好，今天与大家分享一篇发表在Nucleic Acids Research上的文章《Hybridization-based in situ sequencing (HybISS) for spatially resolved transcriptomics in human and mouse brain tissue》，通讯作者是斯德哥尔摩大学的Mats Nilsson教授。Mats Nilsson教授课题组主要从事液体活检及空间转录组学方向的研究。
转录组的原位检测技术为研究基因表达和细胞分型等提供了空间维度信息。基于锁式探针和滚环扩增 (RCA) 的的原位测序技术 (ISS) 已被广泛用于组织切片中转录本的空间维度分析。作为首创者之一，作者进一步对ISS技术进行了优化，提出了基于杂交的原位测序技术 (HybISS)，提高了信噪比和检测通量。
图1. HybISS方法概述。
作者设计了一种条形码锁式探针 (PLP)，能特异性结合靶标RNA逆转录产生的cDNA，并在连接酶的作用下环化，从而进行RCA，产生亚微米级的单链DNA扩增产物 (RCP) (图1A)。PLP上还含有一个20 nt的ID序列和20 nt Anchor序列 (图1B)。针对一个基因的转录本，ID序列是相同的。经由RCA产生的RCPs上包含多个重复的ID序列，利用桥探针 (Bridge-probe) 上的互补序列就可以对ID序列进行读取 (图1B)。39 nt的Bridge-probes中17 nt与ID序列互补，另外还含有20 nt的读出检测探针 (Readout-probe) 结合位点 (图1B)。Readout-probes上共价修饰了四种荧光基团中的一种，用于荧光显微镜的检测 (图1B)。ID序列的组合编码能够通过Bridge-probe库的循环结合成像依次进行解码 (图1C)。
使用小鼠脑冠状切片，作者对杂交测序 (SBH) 与传统的连接测序 (SBL) 进行了比较，发现SBL和SBH均能实现转录本的原位检测，内参基因在组织切片上均匀分布，而SBL的总体荧光强度高于SBH (图2A, B, C)。但是对300个RCPs单独进行分析，发现SBH的各通道荧光强度均高于SBL (图2D)。此外，以随机选取的20个RCPs为中心测量荧光强度，发现在某些通道中，SBH不仅具有更高的平均荧光强度，背景荧光也更低，具有更好的信噪比 (图2E, F, G)。此外，对不同的荧光阈值，SBH均能得到更多的荧光点，并且，在一定的阈值范围内，SBH的区分度更加一致 (图2H, I, J)。总体来说，相较于SBL，SBH对每个细胞内RCPs的检测效率更高 (图2K)。
对大面积中枢神经系统或任何组织进行全面分析十分必要，但目前的方法受限于通量、耗时和数据存储的限制，只能对小区域进行成像。HybISS能够对完整的 ~ 60 mm2、10 μm厚度的成年小鼠脑冠状切片中119个基因的转录本进行了全面分析 (图3A, B)。通过5次循环成像及组合解码，HybISS精确解析了所有的靶标转录本，其中很多转录本显示出离散分布，包括皮质组织的层状结构 (图3B, C, D)。
图2. HybISS与SBL-ISS的比较分析。
图3. HybISS分析小鼠冠状脑切片中的转录本。
虽然小鼠组织能够提供有价值的数据，但人类样本的研究是最重要的。作者用HybISS对取自颞中回的三个脑组织切片 (~ 29mm2, ~ 45mm2, ~ 25mm2, 10 μm厚) 进行了分析 (图4A)。人类大脑样本的一个固有问题是含有脂褐素的残留物，它在多个成像通道中均具有很强的背景荧光，任何猝灭方法都不能完全解决这个问题。作者将HybISS与简单的荧光猝灭剂 (TrueBlack Lipofuscin autofluorescence Quencher, TLAQ) 相结合，成功的克服了这个问题，并且对120个转录本进行了分析 (图4B, C, D)。进一步分析表明，不同基因的转录本具有不同的空间分布，包括皮层组织的层状分布 (图4E)。
图4. HybISS分析人颞中回脑切片中的转录本。
作者在SBL-ISS的基础上，开发了新的原位测序技术HybISS，具有更高的信噪比，更高的通量，可对空间转录组进行精确分析。
