ANGEW丨基于模块组装多功能探针的单细胞单基因RNA G-四链体可视化
今天分享的是近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的一篇文章，标题为Single-Cell Visualization of Monogenic RNA G-quadruplex and Occupied G-quadruplex Ratio through a Module-Assembled Multifunctional Probes Assay (MAMPA)。
有关作者：
本文的通讯作者为清华大学的李景虹教授，其研究方向包括电分析化学、生物分析化学等。
研究背景：
G-四链体（G4）是由鸟嘌呤配对平面堆积成的一种特殊二级结构（图1a）。由DNA或RNA折叠形成的G4能够调节转录、翻译、RNA剪切等过程，具有重要的生物功能。G4也被认为是癌症、神经退行性疾病等的分子靶标。因此，对单个基因中G4功能的研究有重要意义。首先要实现的是单个基因或者RNA中G4的识别。
目前常用的分析G4的方法主要为G4配体荧光探针和G4抗体免疫荧光。这两种方法针对G4的整体结构，能够靶向所有G4，无法区分不同基因中的G4。此外，基于核酸探针互补杂交的方法无法识别G4的二级结构，已报道的肽核酸探针无法实现信号的放大。因此，单基因G4的识别仍存在困难。
整体设计：
图1. MAMPA识别单基因G4的设计示意图。
针对以上困难，本文作者设计了模块组装多功能探针（Module Assembled Multifunctional Probes Assay, MAMPA）。如图1b所示，该探针由识别模块（ID-Probe）与放大模块（Amp-Probe）组成。其中，ID-Probe带有识别G4配体CarboxyPDS与3′-N3修饰，Amp-Probe带有目标互补序列及5′-DBCO修饰，二者分别实现对G4结构以及目标序列的特异性识别。当特定基因上G4结构及目标序列被同时识别，ID-Probe与Amp-Probe通过生物正交反应相连，通过滚环放大反应（rolling circle amplification）产生及放大荧光信号，从而实现细胞内单基因G4的原位识别（图1c-d）。
结果与讨论：
作者首先测试了MAMPA是否能在体外识别特定序列中的G4结构。如图2所示，富含鸟嘌呤的序列WT-RNA仅在ID-Probe与Amp-Probe同时存在时产生较强的荧光信号；相反，对照组G4MUT-RNA无法形成G4结构，因此其荧光信号较弱。作者还进一步通过凝胶电泳的方式验证了WT-RNA能在MAMPA作用下生成滚环放大反应产物。
图2. MAMPA在体外识别特定序列中的G4结构。
随后，作者将MAMPA用于固定的HeLa细胞中BCL2 mRNA G4的识别（图3a-b）。仅当ID-Probe与Amp-Probe同时存在时，BCL2 mRNA G4能产生较强的绿色荧光信号。当G4序列被反义寡核苷酸结合、或者G4被PDS结合时，荧光信号大大降低。作者还比较了MAMPA与BG4免疫荧光对于G4的可视化效果（图3c），他们发现MAMPA产生的信号更加均一、规整。随后，作者优化了MAMPA中ID-Probe的长度以及Amp-Probe的结合位置（图3d-i），以产生最多滚环放大反应产物的Amp-Probe-8 + ID-Probe-12组合用于后续实验。
图3. MAMPA对固定细胞中BCL2 mRNA G4的识别，以及ID-Probe与Amp-Probe的序列优化。
随后，作者进一步拓展了MAMPA的应用和意义，研究对象为原癌基因BCL2 G4。如图4a所示，BCL2 G4的信号表现为绿色荧光点，而BCL2 mRNA表现为红色荧光点。共定位图像显示同一细胞中BCL2 mRNA信号比BCL2 G4更多，说明BCL2 mRNA的部分G4无法被MAMPA检测到。在确认MAMPA信号与mRNA表达水平呈正相关后（图4b），作者推断G4结合蛋白阻碍了MAMPA对BCL2 G4的检测。
为了验证这一猜想，作者比较了MAMPA对BG4抗体处理前/后细胞中BCL2 G4的检测（图4c-d）。他们发现BG4处理后的荧光信号相比处理前显著降低，说明BG4与G4的结合阻碍了MAMPA对G4的检测。他们随即定义了“G4结合比例”这一参数Occupied G4 Ratio = 1-RCAPs (mRNA G4)/RCAPs (mRNA)，其中RCAP为滚环放大反应产物。通过对多个细胞系的比较，作者发现DHX9（一种G4结合蛋白）的敲除显著降低G4结合比例（图4e-g）。
图4. 蛋白与G4的结合影响MAMPA对单基因G4的检测。
最后，作者比较了正常细胞系（MCF 10A, MDA-kb2）与肿瘤细胞系（MCF-7, BT-474, SK-BR-3, MDA-MB-231）的G4结合比例（图5a-b）。他们发现肿瘤细胞系中的G4结合比例相较正常细胞系中更高。此外，肿瘤细胞系也呈现出更高的G4结合蛋白DHX9的表达（图5c-d）。基于上述现象，作者延伸了G4结合比例这一参数的意义：G4结合蛋白可以结合并解开原癌基因的G4结构，进而促进其表达，因此，G4结合比例越高，原癌基因的表达越高。
图5. 正常细胞系与肿瘤细胞系中G4结合比例、DHX9表达水平的对比。
总结：
1. 本文报道了一种基于模块组装的方法用于单基因中G4的检测。
2. 作者提出“G4结合比例”这一参数将G4与肿瘤的发生相联系。
https://doi.org/10.1002/anie.202111132
Yicong Dai, Xucong Teng, and Jinghong Li. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202111132
