NUCLEIC ACIDS RES丨包含人工碱基的高亲和力DNA适配体高特异性检测登革热NS1蛋白变体
大家好，今天分享的文献是2021年11月发表在Nucleic Acids Research上的“包含人工碱基的高亲和力DNA适配体高特异性检测登革热NS1蛋白变体”，作者是新加坡科技研究局的Ichiro Hirao研究员。
关于作者：
Hirao研究员在1997年就开始开展非天然碱基的相关研究工作，并在非天然碱基领域做了大量的研究工作。Hirao研究员在2006年筛选得到了Ds-Pa非天然碱基对，经过结构优化后得到了特异性配对的Ds-Px非天然碱基对。
研究背景：
DNA和RNA适配体是单链的寡核苷酸，可以特异性结合靶标分子，因此有望作为抗体的替代品。适配体最初是通过一种称为SELEX(配体指数富集系统进化)的进化工程方法获得的，该方法涉及使用随机序列文库进行重复循环的选择和PCR扩增。一旦确定了合适的适配体序列，化学合成就可以在GMP规模和高质量控制下提供优化和功能化的适配体。
亲和性和特异性在适配体开发过程中一直存在争议。一般来说，适配体是通过随机序列库的迭代亲和选择得到的。如果适配体的亲和力与靶标的特异性密切相关，则SELEX获得的高亲和力适配体会自发地对其靶标产生特异性。一些数据支持这个假设，但另一些数据不支持。因此，为了系统地研究亲和力和特异性之间的关系，需要更多关于高亲和力适配体的相关研究。
为了研究适配体亲和力和特异性之间的关系，并将UB-DNA适配体用于诊断，作者构建了针对四种血清型登革热病毒非结构蛋白1(DEN-NS1)的高亲和力适配体。登革热(DENV)是一种节肢动物传播的黄病毒，有四种主要的血清类型(DEN1-4)。DEN-NS1蛋白分泌到受感染患者的血液中，是早期最成熟的生物标志物之一。在4个血清型中，DEN-NS1蛋白的序列一致性为69-80%；能够识别不同血清型DEN-NS1蛋白的DNA和RNA适配体尚未见报道。
结果与讨论：
1. 针对每个血清型DEN-NS1的UB-DNA适配体的筛选
为筛选针对每个血清型DEN-NS1的Ds-DNA适配体，作者使用含Ds的文库系统多次执行ExSELEX程序。文库74个子库混合组成，每个子库包含两个Ds碱基，Ds碱基位于42个天然碱基随机序列区域不同的特定位置。作为靶点，4种血清型DEN-NS1蛋白与His-tag融合的，DEN-NS1血清型氨基酸序列一致性为69 ~ 80%。
传统方法使用超滤、电泳凝胶（electrophoresis gelmobility shift assay，EMSA）或His-tag捕获的方法分离，作者采用了一种抗DEN-NS1的单克隆抗体(ab# D06)，可以结合4种血清型DEN-NS1蛋白，KD值在27-107 pM：血清1型(DEN1- NS1)为107 pM，血清2型(DEN2-NS1)为65 pM，血清3型(DEN3-NS1)为75 pM，血清4型(DEN4- NS1)为27 pM。Ds-DNA库与每个DEN-NS1血清型混合，然后NS1-DNA复合物被Ab # D06抗体捕获固定。在这个抗体捕获方法中，寡核苷酸适配体是作为三元复合物Ab # D06-NS1-适体分离出来，因此它们可以直接用于夹层ELISA形式。将未结合的DNA物种从平板上洗去，将与平板上的NS1抗体结合的DNA适配体分离并采用PCR扩增。
2. 6个碱基字母表的UB-DNA适配体靶向DEN2-NS1
作者筛选获得了一系列特异性结合4种血清型DEN-NS1蛋白的适配体。一个值得注意的例子是，在以2型DEN-NS1蛋白(DEN2-NS1)为靶标通过ExSELEX筛选得到的UB-DNA适配体，其中一个序列家族(D2-1)与DEN2-NS1亲和度最高，它们包含两个Ds碱基和一个Px碱基。D2-1家族中增加的这一个Px碱基极有可能是ExSELEX PCR扩增过程中，aptamer链中天然碱基突变为Px的结果。
3. 适配体优化及酶联免疫吸附试验
通过电泳筛选，作者最终敲定了针对4种血清型DEN-NS1蛋白的适配体进行后续试验，分别是：靶向DEN1-NS1的AptD1 (D1-1-48h)，靶向DEN2-NS1的AptD2 (D2-1d-72h)，靶向DEN3-NS1的AptD3 (D3-2-59h)以及靶向DEN4-NS1的AptD4 (D4-3-57h)。每个家族中的大多数序列都包含一个同源序列，其两侧有形成茎环结构的互补基序，使用每个候选基因的删除变体进行的结合实验表明，这些茎和环结构对于每个靶标的紧密结合是必不可少的。有趣的是，作者发现高亲和性适配体的茎段总是位于它们的末端。此外，为了提高适配体的热稳定性和酶稳定性，并促进其固定化，作者在其3’-末端添加了热稳定性良好的生物素标记DNA序列(mini-发夹DNA)，CGCG(Biotin-T)AGCG。他们用化学方法合成了这些优化的UB-DNA适配体，以便于用于后续的实验研究。
EMSA(图3A)和表面等离子体共振(SPR)分析(图3B)证实了每个适配体对其血清型DEN-NS1的高特异性。非天然碱基突变为天然碱基后的变体适配体对靶标的亲和力显著降低，上述实验表明这些非天然碱基对于适配体的结合能力是必要的(图3A)。AptD1、AptD2、AptD3和AptD4对其靶DEN-NS1的KD值分别为182、104、57和30 pM(图3B)。
每个血清型DEN-NS1的检测采用三明治式ELISA形式，使用抗体Ab#D06作为主要检测剂，适配体作为捕获剂(图3C)。信号检测使用二级抗IgG酶标抗体通过比色输出。采用适配体-抗体夹心系统的ELISA形式根据他们报道的方法进行了优化，包括确定合理的固定化适配体数量。每个适配体都特异性检测其靶向的血清型DEN-NS1，未与非靶向血清型DEN-NS1或两株寨卡NS1蛋白发生交叉反应(图3C)。在缓冲液和10%人血清中，对每个DEN-NS1的检出限分别为1.19-2.36 ng/ml和1.14-3.31 ng/ml，达到了实际使用本ELISA方法所需的灵敏度。患者血液中分泌的DEN-NS1浓度范围为几个ng/mL到几百ng/mL。
4. AptD2的G4结构
以DEN2-NS1为靶点的适配体AptD2在环区包含6个G-tracts，表明G四链体结构的形成。因此，作者研究了G四链体的可能性，并确定了AptD2中哪些G-tracts参与了G四链体。为此，他们开发了一种G- To - A扫描方法，使用AptD2-1 (63-mer)的一系列单点G→A变体:对G15A、G25A、G28A、G32A、G37A、G43A或G48A单突变的对应适配体AptD2-1a到AptD2- 1g(图4A)。由于Ds碱基在约300 nm处的吸光度与G四链体特异性吸光度在295 nm处重叠，使得对G四链体结构的常规光谱分析变得困难。因此，他们比较了这些G→A变体与DEN2-NS1的结合能力、紫外光谱和热熔谱，并与AptD2-1进行了比较。
通过这种G-to-A扫描，他们们确定了由四个G-tracts (G24-25、G31- 33、G36-38和G42-44)组成的G四链体。EMSA检测显示，只有AptD2-1c (G28A)与DEN2-NS1结合，说明其他6个Gs (G15A、G25A、G32A、G37A、G43A和G48A)是必需的(图4B)。AptD2-1b、-1d、-1e和-1f四种变异体的相对吸光度随AptD2-1的吸光度归一化后，在300 nm左右的相对吸光度与AptD2-1a、-c和-g的相对吸光度有明显的不同(图4C)。与AptD2-1和其他三种变异体(AptD2-1a、-1c和-1g)相比，这四种变体在260 nm处的热熔化曲线变宽，表明结构的热失稳(图4D)。最后，AptD2-1和三种变体(AptD2-1a、-1c和-1g)在295 nm处的熔化曲线提供了G四链体特有的特征模式(图4E)。这些结果支持了AptD2-1中G24-25、G31-33、G36-38和G42-44区域中至少两个G四链体的形成。
5. 患者样本中DEN-NS1的血清型特异性检测
使用10名新加坡登革热患者(PD1-1至PD4-1)发热后3 - 5天内的血液样本，作者评估了ELISA形式检测DEN-NS1血清型的敏感性和特异性。每个样本的登革热血清型先通过成熟的检测技术进行区分，通过RT-PCR检测了每个患者样本中的DEN-NS1序列，并对编码DEN-NS1的mRNA进行测序。利用这些常规测序方法，他们确定病人PD1-1、PD1-2和PD1-3为1型(DEN1-NS1)， PD2-1、PD2-2和PD2-3为2型(DEN2-NS1)， PD3-1、PD3-2和PD3-3为3型(DEN3-NS1)， PD4-1为4型(DEN4-NS1)。这些临床样本的序列分析显示，每个血清型的DEN-NS1都有几个氨基酸突变，其中一些与从The Native Antigen Company购买的ExSELEX靶蛋白DEN-NS1不同。
他们的ELISA检测了PD1-1、PD2-1、PD3-1、PD3-2、PD3-3和PD1-1血清样本中的每一种DEN-NS1血清型(图5)，但未检测到PD1-2、PD1-3、PD2- 2和PD2-3血清型。酶联免疫吸附试验采用抗体-抗体三明治对形式Ab#D06和Ab#D25。商用LFA系统(SD BIOLINE)在所有样本中可检测到DEN-NS1(图5和补充表S1)，但商用LFA系统不能确定它们的血清型。
这些样品间检测灵敏度的差异与每个DEN-NS1血清型的细微氨基酸差异密切相关。在患者样本中，他们的适配体检测到了与从The Native Antigen Company购买的DEN-NS1 (NAD1)具有较高氨基酸序列一致性(>96.9%)的DEN-NS1蛋白(图5)。PD1-1的DEN1-NS1与NAD1的序列同源性为98.9%，可用AptD1酶联免疫吸附测定。PD1-2和PD1-3与NAD1的序列同源性为96.3%，用AptD1未检测到。同样，PD2-1、PD2-2和PD2-3的DEN2-NS1与the Native Antigen Company (NAD2)的序列一致性分别为98.0、96.6和96.6%，AptD2几乎仅检测到这三种变体中序列一致性最高的PD2-1样本。DEN3-NS1和DEN4-NS1与NAD的序列一致性为96.9−98.9%，AptD3和AptD4可检测每个DEN-NS1。这些结果表明，他们的UB-DNA适配体对靶标具有高特异性。
6. 针对DEN1-NS1变体2的UB-DNA适配体的合成
为了评估这些UB-DNA适配体的特异性，他们对源自PD1-2的DEN1-NS1亚型变体2进行了ExSELEX实验，因为AptD1未检测到该变异。靶标蛋白DEN1-NS1变体2通过常规CHO细胞表达系统制备。他们也以感染DENV的患者临床样本为靶标。他们进行了7轮ExSELEX实验，在第一轮、第二轮、第三轮和第六轮实验中，他们使用了制备好的变体2蛋白。对于其他轮，他们直接使用DENV患者的血清(PD1-13)，其中含有DEN1-NS1，其序列与变异2相同。在选择步骤中，将DNA文库与血清孵育，使用固定化的ab# D06抗体捕获DNA-靶蛋白复合物。经过7轮筛选，他们从富集文库中分离出一个与DEN1-NS1变异体2特异性结合的优势序列家族(19D1F1)。在EMSA中，即使凝胶中存在2M尿素，他们也观察到适配体-靶蛋白复合物的条带，证实了其对DEN1-NS1变异体2的特异性和对Ds碱基的依赖性。最后，他们利用生物素化的mini-hairpin DNA对该序列进行了优化和扩展，产生了AptD1b (19D1F1-3)适配体，KD值为27 pM。
使用AptD1b和ab# D06三明治对的ELISA实验仅能有效检测患者PD1-2、PD1-3血清中的DEN1-NS1变异2，但不能检测PD1-1和从The Native Antigen Company购买的所有四种DEN1-NS1血清型 (图6C)。因此，含有两个Ds-DNA的AptD1和AptD1b适配体，可以识别DEN1-NS1的亚血清型变异体1或变异体2，其在352个氨基酸中有10个氨基酸差异。
7. 采用AptD1和AptD1b酶联免疫吸附试验(ELISA)高特异性检测临床标本中的DEN1-NS1变体
两个含Ds-DNA的适配体AptD1和AptD1b分别敏感识别DEN1-NS1变异体1和变异体2。为了使用这两种适配体评估ELISA实验的灵敏性和特异性，他们检测了22个新加坡临床样本的DENV血清1型感染，样本在病人发烧后3 - 5天内获得(PD1-1到PD1-22)，以及在从未感染过DENV的日本人身上采集的对照人血清(PD0-1)。登革热RT-qPCR检测试剂盒(Fast Track Diagnostics)没有检测出22份样本中变异1和变异2的序列差异性。他们通过RT-PCR检测所有临床样本的DEN1-NS1序列，并对每个样本中提取的DEN-NS1编码的mRNA进行测序。根据病毒RNA测序的序列一致性，大多数患者样本被划分为两个家族，DEN1-NS1变种1和DEN1-NS1变种2。7例患者DEN1-NS1序列与变异体1 (NAD1和PD1-1)序列同源性高(98.3%)。其他10例患者样本的序列与变异体2的序列相似度≥99.7%，变异体2与变异体1的序列一致性为≤96.3%。
与PD0-1的信号相比，他们的ELISA实验在22例患者样本中检测到21例DEN1-NS1，除了PD1-9(图7B)。在21例患者样本中，两个UB-DNA适配体，AptD1和AptD1b明确识别出DEN1-NS1变异体1和变异体2。使用抗体Ab#D06和抗体Ab#D25的抗体-抗体夹心系统的ELISA检测了除PD1-9 (图7B中的灰色条形)以外的所有样本中的DEN-NS1蛋白。实验结果与这些临床样本的序列分析完全一致。
核酸适配体-抗体和抗体-抗体对的ELISA实验均检测不到在PD1-9中的DEN1-NS1。这是由于由于继发性DENV感染，该临床样本含有DEN1-NS1的IgGs，因此患者的抗DEN1-NS1 IgGs竞争性地降低了ELISA实验的检测灵敏度。
总结：
作者通过引入非天然碱基(unnatural bases, UBs)作为第五个碱基，DNA的基因字母表得以扩展，并极大地增强了DNA适配体与靶标蛋白结合的亲和力。为了确定筛选得到的UB-DNA适配体是否能够自发地获得高特异性，作者针对4个血清型登革热非结构蛋白1 (DEN-NS1)分别生成了一系列UB-DNA适配体(KD: 27-182 pM)。每个适配体的特异性都非常高，能够识别DEN-NS1的细微变化，其氨基酸序列一致性应至少达到96.9%，超出血清型识别的能力(69-80%的序列一致性)。作者筛选的得到的UB-DNA适配体可在新加坡临床样本中特异性鉴定出登革热1型非结构性蛋白（DEN1-NS1）的两个主要变种，其DEN-NS1蛋白(352 aa)存在10个氨基酸差异。这些结果表明，亲和筛选得到的UB-DNA适配体具有较高的靶向特异性。有趣的是，其中一个适配子包含两个不同的UBs，分别是Ds和Px，这两个碱基的存在是与靶标蛋白紧密结合所必需的。这两种具有不同理化性质的非天然碱基极大地扩展了DNA适配体的潜力，结合UB-DNA适配体的检测方法将有助于对病毒感染和其他疾病的精确诊断。
