NAT CHEM丨一种能识别单位点突变的切割 RNA 的苏糖核酸酶
大家好，今天分享的是2021年12月发表在《Nature Chemistry》上的一篇文献，标题为: An RNA-cleaving threose nucleic acid enzyme capable of single point mutationdiscrimination。
通讯作者为南京大学现代工程与应用科学学院的于涵洋和李喆教授。于涵洋教授课题组的主要研究方向为人工核酸，包括基于人工核酸的化学生物学和合成生物学，探索和建立人工核酸相关的新技术；李喆教授课题组的主要研究方向为DNA纳米技术在生物医学领域的应用。
研究背景：
核酸是生命体的基本组成成分，包括DNA和RNA。其中，RNA既能像DNA一样存储和传递遗传信息，又能像蛋白质一样催化生物化学反应。因此，研究生命起源的科学家们提出了“RNA世界假说”，认为地球早期的生命形式可能使用RNA这一类分子同时承担“遗传物质”和“酶”两个角色。
但是RNA是不是唯一可能的遗传物质呢？为了探索这个问题，Eschenmoser等合成了一系列RNA类似物并研究了其基本的物理和化学性质。在这项研究中，他们发现了苏糖核酸（threose nucleic acid, TNA）能够与互补的DNA、RNA或TNA链遵循碱基配对原则形成反向平行的双螺旋结构。而且，考虑到TNA由更简单的苏糖组成，所以TNA被视作生命演化过程中一种可能的前RNA遗传物质。作为前RNA遗传物质，TNA除了需要具备信息存储和传递能力之外，还需要具有催化生物分子发生化学反应的活性。那么TNA是否具有催化活性呢？
筛选方法：
针对这一问题，该研究的作者们综合运用合成化学与定向进化的手段，从随机文库中鉴定了多个具有RNA内切酶活性的TNA序列。这些TNA酶催化RNA底物在特定的位点发生切割反应（图1）。其中，Tz1具有最高的催化活性，可催化特定的RNA底物在G|C处切割（图1b）。
图1. TNA 酶催化 RNA 切割反应
（a）TNA 和 DNA 重复单元的化学结构；（b）通过 RNAfold 预测的 TNA 酶 6-29 和Tz1 （TNA 以蓝色显示）与 Cy5.5 标记的 RNA 底物（灰色显示）的二级结构，箭头表示切割位点；（c）TNA酶催化 RNA 切割反应的时间过程。
通过对 TZ1进行系统的生化表征（图2），发现Tz1催化活性依赖于镁离子，在其他二价金属离子如锰离子存在时，也有一定的催化活性（图2a）。此外，Tz1在pH 7.5和20 mM 镁离子反应条件下，表观反应速率常数为0.016 min-1（图2b）。对不同pH 范围内的活性测定，显示Tz1的反应速率常数在pH 3.7到pH 5.3范围内随着 pH 值的增大而增加，在pH 5.3时基本达到最大，并且在 pH 5.3 到 pH 9.0 范围内保持相对恒定（图 2c）。Tz1 能够在多次周转条件下切割 RNA底物，分别在 3 h 和 6 h 内达到 2.00±0.02 和 3.46±0.01 的周转率（图 2d）。
（a）Tz1 催化 RNA 切割反应的二价金属离子依赖性；（b）Tz1 催化 RNA切割反应的动力学表征；（c）切割反应速率常数的 pH 依赖性；（d）多周转条件下 Tz1 催化的 RNA切割反应的代表性凝胶图像。
因为RNA是细胞内遗传信息流动的关键一环，因此可作为生物医药领域的重要靶点。作者们尝试使用Tz1切割一个EGFR（表皮生长因子受体）突变基因转录的RNA 序列，该突变导致非小细胞肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂类的靶向药产生耐药。作者们意外地发现Tz1能区分RNA 底物上的单位点突变，即选择性切割发生了突变的基因转录本，而不切割正常的基因转录本（图3）。而对照组，6-29以及脱氧核酶10-23（Dz），可同时对野生型以及发生了突变的序列进行切割。另外，通过考察不同Buffer条件下的切割活性，发现Tz1可以在接近生理条件下（PBS, 2 mM Mg2+），选择性切割发生了突变的RNA序列。
图3. Tz1 选择性切割突变体 EGFR 的转录本
（a）野生型 (WT) 和突变 RNA 底物模型序列，突变位点以红色显示。箭头表示不同酶的切割位点；（b-c）不同缓冲液中 Tz1 催化的 RNA 切割反应；（d）不同反应条件下（酶/底物比、镁离子浓度、反应时间），Tz1 与脱氧核酶 10-23 (Dz) 的底物选择性分析。
利用这一性质，作者们进一步展示了Tz1在细胞内介导高度选择性的基因沉默作用（图4）。首先，通过对 A549以及H1975 细胞转录物的切割反应，在体外验证了Tz1可以特异性切割由 EGFR基因转录形成的RNA产物。然后，通过逆转录定量 PCR 以及 Westernblot 在mRNA和蛋白表达水平评估Tz1 在 A549 和H1975 细胞中的选择性基因沉默作用。结果表明，转染 Tz1 后，与未处理实验组相比，H1975细胞中 EGFR 突变 mRNA 的含量减少至75%，而在 A549 细胞中，Tz1处理没有导致显著的差异（图 4b）。相比之下，将脱氧核酶 10-23 或对照TNA 转染至 A549 或 H1975 细胞并未显着影响EGFR 的蛋白表达（图4c）。
图4. Tz1 在肺癌细胞系 A549 和 H1975 中介导选择性基因沉默
（a）Tz1 在体外对 EGFR 外显子 20 转录物的切割；（b）逆转录定量 PCR分析细胞内EGFR 转录的 mRNA的相对含量；（c）Western blot 分析细胞内 EGFR的表达。
综上所述，该研究工作鉴定了具有RNA内切酶活性的TNA序列，表明TNA 能够折叠成具有催化活性的复杂三级结构，为TNA作为原始遗传物质提供了进一步的实验支持。此外，该TNA 酶能区分底物 RNA上的单位点突变，在细胞内选择性沉默突变基因的转录本，为基因治疗提供了一种基于非天然核酸的新型工具分子。
Wang, Y., Wang, Y., Song, D. et al. An RNA-cleaving threose nucleic acid enzyme capable of single point mutation discrimination. Nat. Chem. (2021). https://doi.org/10.1038/s41557-021-00847-3
