NATURE丨序列影响MicroRNA的EVs释放或在细胞保留

  这次分享的文献是21年12月发表在NATURE上的MicroRNA sequence codes for small extracellular vesicle release and cellular retention。

有关作者：

  本文的通讯作者哈佛医学院教授C. Ronald Kahn教授是世界公认的糖尿病和肥胖研究专家，也是胰岛素信号转导和糖尿病和代谢疾病信号机制领域的杰出研究者。

研究背景：

  MicroRNA（miRNA）是由体内几乎所有细胞都能产生的约22 nt的调节性小的非编码RNA。许多miRNA在进化过程中是高度保守的，人类产生2，000至3，000个miRNA。miRNA在细胞和组织之间的通信具有重要的作用，而这种通信是miRNA的细胞外转运为基础的。而是什么决定了哪些 miRNA 被分泌并因此可能发挥这种信使功能仍然很大程度上未知。

整体思路：

  这篇研究分成两个部分，第一部分在5种不同的细胞系中（分化的3T3-L1细胞（白色脂肪细胞）永生化分化的棕色脂肪细胞（BAT），分化的C2C12（骨骼肌）细胞、SVEC（内皮）细胞和AML12细胞（肝细胞））探究了不同细胞系间的miRNA差异与外泌体与细胞内的miRNA差异并发现了决定miRNA定位的motif（包括细胞定位的CELLmotifs 和外泌体定位的EXOmotifs）。第二部分则是验证性研究，验证CELLmotifs and EXOmotifs确实可以调控miRNA的去向，找到了可能的参与的蛋白-两种RNA结合蛋白Alyref and Fus，并探究了其应用前景：通过人为给miRNA增加Exomotif来增加其外泌体分泌—增强细胞间的通信与效应。

结果与讨论：

  作者先探究了不同细胞系间的miRNA差异，分析了分泌的外泌体的量和其中miRNA的量：不同类型的细胞释放不同数量的外泌体，3T3-L1脂肪细胞的每细胞产生和释放率最高，C2C12肌管的每细胞产生和释放率最低，这与脂肪组织是体内循环外体/外泌体 miRNA的主要贡献者的观察结果一致，外泌体的RNA含量与释放的囊泡总数平行。并进行了PCA分析，发现同群的聚群较好说明每种细胞类型都有不同的miRNA图谱，也反映了取样重复性良好，同时不同群也出现聚集说明细胞内与外泌体中miRNA组成的相似性。

  研究人员通过比较了每种细胞或外泌体中每个miRNA的水平，确定了一些细胞特异性miRNA：在细胞体中评估的664个miRNA中，210个miRNA（32%）在一种细胞类型中的表达明显高于其他四种，即显示出细胞类型特异性；类似地，与其他细胞类型的囊泡相比，约三分之一的外泌体 miRNA（218/660）在一种细胞类型的囊泡中富集，并可用于预测来自不同器官（如血液）的混合外泌体情况下的起源组织。然而，大部分的（73–92%）有细胞来源特异性的外泌体的miRNA也在其他细胞类型的细胞体中以类似或更高水平表达——说明了细胞分泌外泌体中的miRNA也是存在选择性的，也说明不能简单地确定外泌体中miRNA的起源组织。既然特异性细胞miRNA与特异性外泌体miRNA的细胞系来源并不对应，作者就进一步探索那细胞体内的miRNA与外泌体中中内的miRNA之间是否存在可以区分的特异性？比较细胞体和外泌体中每个miRNA的相对水平，发现miRNA分泌和保留的独特模式：当与其细胞体相比较时，一些miRNA在所有五种细胞类型的外泌体中富集；另一些miRNA仅在一种或两种细胞类型的外泌体中选择性富集；还有一些miRNA在外泌体中很少或根本不存在，尽管存在于细胞体中。最后，一些miRNA，如miR-138b-5p和miR-501-5p，在所有细胞类型的外泌体和细胞体中显示出几乎相同的相对表达。进一步分析将外泌体中miRNA的相对丰度除以其在细胞体中的相对丰度证明了外泌体和细胞之间miRNA的范围差异排序，一些miRNA在外泌体中显著富集，而其他miRNA在细胞体中显著富集。28%至57%的表达miRNA在外泌体或细胞体中显示选择性富集，具体取决于细胞类型。43个miRNA显著保留在所有细胞类型的细胞体中，而13个miRNA显著富集在所有细胞类型的外泌体中。然而，许多miRNA仅在单个或有限数量的细胞类型中在细胞体或外泌体中显著富集，这表明存在细胞间不同的特异性机制。对其中位置特异性的miRNA进行分析。为了确定miRNA分类的潜在机制，对miRNA序列和结构进行分析，以发现外泌体或细胞体富集的miRNA。与保留在细胞中的miRNA序列相比，外泌体富集水平较高的miRNA序列具有较高的G+C含量和较低的Gibbs自由能。

  为了确定导致差异排序的miRNA中的潜在序列，对每种细胞类型的富含外泌体或富含在细胞体的miRNA进行了电子序列分析，并将其与未在外泌体中富集或细胞中富集的miRNA序列进行比较。对于每种细胞类型，可以识别一到四个4-7个核苷酸的基序，大多数具有高G+C含量，这些基序与外泌体中的富集显著相关，称这些为EXOmotif。例如，对于SVEC细胞，鉴定出四个基序，每个基序都可以在13.5–46%的外泌体富集的miRNA中找到，并且与细胞中的其他miRNA相比，外泌体富集的miRNA的富集程度为3.4–80倍。并且一些外基序对单个细胞类型具有特异性，而有的基序存在于两种或两种以上的细胞类型，尽管有时略有变化。类似的分析确定了每种细胞类型的细胞富集miRNA（细胞基序）中长度为4-5核苷酸的两到五个基序。这些基序显示出3到9倍的富集，并且G+C含量较低。同样，CELLmotif与miRNA在一种以上甚至所有细胞类型中的细胞保留密切相关，而大多数CELLmotif仅限于一种或两种细胞类型。尽管模体识别分析倾向于识别长的模体，但是短的4-核苷酸基序（通常位于长基序的核心），在不同细胞类型的富含外泌体和细胞的miRNA中被反复鉴定。事实上，在重点关注4-核苷酸模式的同时重复模体分析，能够识别较短模体的家族。将这些命名为核心EXOmotif和核心CELLmotif。与扩展基序相比，它们的富集度较低，但在细胞类型中表现出更多的丰度和共性。这些核心EXOmotif和核心CELLmotif共同覆盖了大部分miRNA：62%的sEV富集miRNA和65%的细胞富集miRNA，且基序的作用叠加的：在所有细胞来源的外泌体中显著富集和在所有细胞类型的细胞体中显著富集的miRNA的平均含有的核心基序为2.4和1.8。重要的是，无论是核心和延伸的EXOmotif和细胞基序通常位于miRNA的3′一半，即远离种子序列。

  在后半部的验证性研究中，为了确定这些排序基序是否足以通过诱变改变细胞和外泌体之间的miRNA分布，从miRNA中引入或去除了基序，在将CELLmotif AGAAC引入外泌体中富集的的miR-431-5p序列导致其外泌体富集减少35%，同时当miR-140-3p中的AGAAC细胞基序被破坏，其在外泌体中的含量分布。对EXOmotif的实验得到了相似的结果。因此，所鉴定的CELLmotif和EXOmotif参与miRNA的保留与分泌，它们的引入或去除可以作为一种工具来显著改变miRNA的分布。基于上述数据，假设外基序和细胞基序与特定的miRNA结合蛋白相互作用是分选机制的一部分。使用与生物素化的miR-34c或miR-26a孵育的细胞裂解物进行了下拉实验，同时包括野生型与引入CNGGNG型的EXOmotif形态。然后对与各种miRNA结合的蛋白质进行液相色谱分析，然后进行串联质谱（LC–MS/MS）蛋白质组学分析。在鉴定的67种蛋白质中，发现了RNA结合蛋白。在含有EXOmotif的miRNA相比其野生型形态其结合的蛋白（选择的两者之间的至少8倍差异的蛋白）：发现了以下五种蛋白：Alyref, Rbmx, Sdpr, Fus 和Syncrip。其中Alyref是miR-34c-CGGGAG的最好的结合蛋白，并且也被证明在从细胞核输出RNA中起作用。而Fus已被证明与Ago2和miRNA相互作用。为了探索这些蛋白质的参与，将重点放在Alyref和Fus上，通过siRNA介导的敲除将Alyref或Fus蛋白水平降低约50%后，导致含有CGGGAG的miRNA分类减少约50%。

  最后作者对其潜在应用进行了探索：通过外基序的引入用于操纵miRNA分泌并增强sEV miRNA向靶细胞的传递。开发了一种Transwell系统，其中棕色脂肪细胞表达对照组混乱的miRNA，与携带CAUG或CNGGNG（CGGGAG）外基序的野生型miR-34c或miR-34c与AML12肝细胞共培养，在与过度表达野生型miR-34c的供体细胞共同培养的受体细胞中，野生型miR-34c水平略有增加。供体和受体拷贝数的比较显示，只有0.3%的野生型miR-34c供体拷贝转移到受体细胞。相比之下，在与过度表达这些含有外基序的miRNA版本的供体细胞共同孵育的受体细胞中，可以检测到相对数量高出16倍以上的miR-34-CAUG（4.8%）和miR-34c-CGGGAG（5.1%），这表明向靶细胞的递送效率更高，并且与这些miRNA的sEV富集增加一致。这种改进的递送导致受体细胞中miR-34c靶28–31的下调增强。因此，表明向靶细胞的递送效率更高，并且与这些miRNA的sEV富集增加一致，功能表征显示受体细胞中miR-34c靶的下调增强。

总结：

  综上，研究人员发现miRNA具有确定其在外泌体（EXOmotifs）或细胞滞留（CELLmotifs）的基序，并且在不同的细胞类型，优先使用特定的分泌序列，因此具有细胞类型特异性外泌体miRNA谱。在miRNA中插入或删除这些CELL motifs 或 EXO motifs会增加或减少细胞中产生或分泌到外泌体的miRNA。

两种RNA结合蛋白Alyref和Fus参与具有EXO motif（CGGGAG） miRNA的输出。 EXO motifs介导的miRNA传递增加会造成对远处细胞中靶基因的抑制作用增强。因此，该miRNA序列不仅提供了人们对循环外泌体miRNA来源组织的理解，还提供了一种改进RNA介导靶向治疗的思路。

Garcia-Martin, R., Wang, G., Brandão, B.B. et al. MicroRNA sequence codes for small extracellular vesicle release and cellular retention. Nature 601, 446–451 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-021-04234-3