韩 达 课 题 组

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NAT CHEM BIO丨靶向聚糖降解增强体内抗癌免疫反应

作者:高倩倩

目前批准的针对 PD-1 和 CTLA-4 受体通路的免疫检查点抑制剂疗法是某些癌症的有力治疗选择;但大多数癌症类型的患者对此种免疫疗法没有响应或无法长期响应,并且与此相关原发性和继发性耐药的潜在机制尚不清楚,可能还有其他免疫调节剂在起作用。研究发现唾液酸聚糖通过多种机制抑制免疫激活并充当糖免疫检查点。2020年发表在Nat.Chem.Biol.的文章“Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo”以糖免疫检查点为研究对象进行了研究,本文的通讯作者是来自斯坦福大学的Carolyn R.Bertozzi教授。 

  在本研究中,作者证明抗体-唾液酸酶偶联物可以从癌细胞中去除唾液酸聚糖,并可以通过 Siglec-E 依赖性机制改善小鼠的抗肿瘤免疫反应,作者对这一概念进行了完整验证。

  首先,作者设计了一种抗HER2抗体-唾液酸酶结合物,能够靶向性去除乳腺癌细胞上唾液酸多糖,解除对免疫细胞的抑制作用。

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1 Siglec 配体与抗体-酶偶联物 T-Sia 2 靶向脱唾液酸化作为免疫治疗的一种方式。

  靶向性优化作者之前报道了一种抗体唾液酸酶分子T-Sia1,它是由来源于VC唾液酸酶与曲妥珠单抗偶联而成的。但是T-Sia1靶向性很差(相当大的程度上不依赖于曲妥珠单抗的活性),作者将其归因于:来源于 VC的唾液糖苷酶表观KM值较低。作者发现鼠伤寒沙门氏菌 (ST) 唾液酸酶针对多价靶标的具有相对较高的 KM 值,且能增强 NK 细胞介导的 ADCC作用。为了确定ST唾液酸酶是否可以对不同细胞表面唾液酸聚糖选择性地发挥降解活性,作者使用先前报道的类似连接策略将该酶与曲妥珠单抗偶联。接下来,作者共培养HER2+ SK-BR-3和HER2- MDA-MB-468细胞,比较曲妥珠单抗ST唾液酸酶与T-Sia1的结合物对不同HER2表达水平细胞表面唾液酸聚糖的降解活性和选择性。使用凝集素 (SNA) 作为细胞表面唾液酸聚糖的探针,T-Sia 1 导致 MDA-MB-468 细胞大量脱唾液酸化,EC50 为 38 nM,而曲妥珠单抗-ST 唾液酸酶完全消除了脱靶反应性(EC50 为~1μM)(图 2c)。然而,T-Sia 1 导致 MDA-MB-468 细胞大量脱唾液酸化,EC50 为 38 nM,而曲妥珠单抗-ST 唾液酸酶完全消除了脱靶反应性(EC50 为~1μM)(图 2c 和补充图 4c)。此外,ST唾液酸酶偶联物保留了增强中等和低表达水平HER2的细胞的NK细胞介导的ADCC的能力(图2d)。

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2.ST唾液酸酶裂解唾液酸并增强 NK 细胞导的 HER2+ 细胞 ADCC,减少 HER2 细胞的脱唾液酸化

优化 T-Sia2 的化学稳定性先前的抗体与酶之间的肟连接缺乏稳定性,在这里作者使用HIPS化学方法,研究人员用碳碳键有效取代了肟,极大地提高了抗体与酶支架连接的稳定性。

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3 T-Sia 2 的合成

T-Sia2抗肿瘤功能研究:

1、体外实验:作者以改造的小鼠EMT6乳腺癌细胞(表达HER2,但仍对曲妥珠单抗治疗耐药)为研究对象,用T-Sia2切割其表面唾液酸聚糖,发现T-Sia2增强NK细胞介导的ADCC的作用。

2、体内实验:将HER2+ EMT6细胞注射到小鼠乳腺脂肪垫中,然后用PBS、曲妥珠单抗或T-sia2经腹腔注射途径治疗。28天后,PBS组与曲妥珠单抗组的所有小鼠都达到需要安乐死的肿瘤负荷(图4b,4c)。相比之下,与单独使用曲妥珠单抗或PBS相比,两种剂量的T-Sia2均可将小鼠的生存期延长至40天,并显著延迟肿瘤生长(图 4c、d 和扩展数据图 4a)。两种剂量的T-Sia 2 之间没有观察到肿瘤生长的差异(图 3c)。

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4 T-Sia 2 在对单独曲妥珠单抗耐药的 HER2+ EMT6 同基因小鼠乳腺癌模型中降解唾液酸聚糖并减缓肿瘤生长

T-Sia2抗肿瘤活性的机制探究

(1)为了更好地理解T-Sia2抗肿瘤机制,作者使用与T-Sia2相同的偶联策略合成了三个对照分子(图5a)。第一个是T-Sia-LOF,其中唾液酸酶的催化​​亲核试剂发生突变(Y→A),导致功能丧失。第二个是同种型对照人 IgG1-唾液酸酶偶联物与抗体 motavizumab,该抗体靶向实验室小鼠中不存在的抗原(呼吸道合胞病毒),并且与曲妥珠单抗(同种型-Sia)具有 87% 的同一性。第三个是在曲妥珠单抗的 Fcγ 受体 (FcγR) 结合域中具有多个点突变 (ELLG→PVA-) 的变体,它消除了免疫细胞上的大多数效应 FcγR 相互作用,同时保持了大部分新生儿 Fc 受体 (FcRn)结合功能。体外NK细胞介导的HER2+细胞系ADCC检测表明,T-Sia在诱导细胞死亡方面优于曲妥珠单抗,而T-sia-LOF的活性与之相差不多(图5b)。与预期的一样,Isotype-Sia对HER2+细胞的ADCC刺激无效,T-FcX-Sia与T-sia2相比,在体外大大降低了ADCC功能。由于体内治疗中, Isotype-Sia会在小鼠体内循环,因此非靶向性的Isotype-type也可能会降解TME(肿瘤微环境)中的唾液酸聚糖。作者注射20pmol剂量的T-Sia2、Isotype-Sia或PBS,如图5c所示,4d后收集肿瘤细胞,流式细胞术分析其与凝集素的结合,与之前的结果一致,Isotype-Sia治疗的肿瘤比T-Sia2具有更多的肿瘤唾液酸多糖(图5c),这表明在TME中,曲妥珠单抗可以提高唾液酸酶降解唾液酸多糖的能力。

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 5 | 活性唾液酸酶对于 T-Sia 2 在小鼠中的功效至关重要,HER2 靶向是有利的,但抗体-FcγR 募集和 ADCC 对体内唾液聚糖降解剂的抗癌免疫反应的贡献可以忽略不计。

(2)T-Sia2 抑制糖蛋白免疫检查点Siglec-E: 之前有证据表明,Siglec-Emight可能在免疫细胞免疫抑制方面发挥重要作用,作者假设 Siglec-E 是免疫抑制表型的一个促成因素,并且推测破坏 Siglec-E 配体是 T-Sia2 在小鼠中发挥抗肿瘤效果的重要机制之一。由于目前没有针对 Siglec-E 的完全拮抗性阻断抗体,因此作者在敲除Siglec-E的C57BL/6小鼠中检测了T-Sia2的作用。HER2+ B16D5 黑色素瘤肿瘤模型在 C57BL/6 小鼠中是同基因的,并表达可被 ST 唾液酸酶切割的 Siglec-E 配体。HER2+的B16D5细胞被注射到野生型(WT)或Siglec-E敲除小鼠的腹侧。7天后,小鼠接受T-Sia2或T-Sia-LOF治疗,并评估肿瘤生长情况。与预期一样,唾液酸多糖降解剂T-Sia2增加了WT小鼠的存活率并延缓了肿瘤的生长(图6b)。在Siglec-E敲除小鼠中,T-Sia2治疗效果没有明显优于T-Sia-LOF(图6c),表明体内唾液酸多糖降解的治疗效果很大程度上依赖于功能性Siglec-E的表达。

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 6 | T-Sia 2 疗法依赖于功能性 Siglec-E,这是一种在肿瘤浸润性髓系细胞上高度表达的受体

总之:作者设计了一种曲妥珠单抗-唾液酸酶偶联物,在前期工作基础上提高了其靶向性和稳定性,并成功将其应用于小鼠体内抗肿瘤治疗。作者证实该偶联物能够靶向性地去除乳腺癌细胞上的唾液酸多糖。在同基因乳腺癌小鼠模型中,抗体-唾液酸酶偶联物增强了小鼠肿瘤部位免疫细胞浸润和激活,延长了小鼠的生存时间,这一作用与小鼠肿瘤部位内浸润的髓系免疫细胞上发现的Siglec-E检查点受体的表达密切相关。综之,抗体-唾液酸酶耦合的免疫检查点阻断疗法有潜力作为新抗癌疗法走向临床转化。

Gray MA, Stanczak MA, Mantuano NR, et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nat Chem Biol. 2020 Dec;16(12):1376-1384. doi: 10.1038/s41589-020-0622-x.

2021年11月5日 09:37
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