NAT BIOMED ENG丨适配体介导无痕分选CD8+T细胞用于CAR-T治疗
作者：齐力轻
CAR-T细胞疗法需要高纯度的T细胞分选系统，与临床用的免疫磁学阳性富集方法不同，基于适配体的无痕分选策略价格低廉，在细胞上不会留下任何痕迹。该文章首先筛选出CD8+ T细胞的适配体，以用于CD8+ T细胞的低成本和高产量的无痕分选系统。捕获的CD8+ T细胞通过结合互补的寡核苷酸链与细胞分离。另外，本研究还发现在B细胞淋巴瘤小鼠模型中，由适配体无痕分选策略分选的CD8+ T细胞制造的CAR-T细胞在增殖、表型、效应功能和抗肿瘤活性方面可与抗体磁分选制造的CAR-T细胞相媲美。基于该方法，也可通过使用多个适配体和相应的互补寡核苷酸，使所需的淋巴细胞亚群从一个系统中完全、有序和无痕的分选成为可能。
Fig 1|T细胞适配体筛选机理图:第一轮用 DNA适配体库对T细胞进行正筛，之后竞争性筛选、磁分选和反筛相结合进行接下来的4轮筛选，其中筛选压力不断增大。
高特异性适配体的产生对细胞分选应用至关重要。本文在cell-SELEX技术上进行了改进，将竞争性选择(在相关不希望的cell存在的情况下进行选择)和反选择(结合不希望的目标的适配体消耗)包括在内。使用具有52nt的随机单链DNA文库对T细胞进行首轮正筛，所选择的适配体库经历了多轮竞争/反筛选。每一轮都包括对T细胞的竞争性筛选，这是通过与PBMCs孵育适配体库，然后分离出T细胞并提取与之结合的适配体来实现的。收集到的适配体与J.RT3-T3.5孵育进行反筛选，去除与T细胞上非特异性表面蛋白结合的适配体。5轮中每一轮的选择严格程度均有所增加，并通过流式细胞术监测筛选进展。通过二代测序及一系列分析，筛选出3条适配体：A1，A3，A8。
Fig2|三条T细胞适配体结合CD8a 糖蛋白。a、50 nM随机(RN)、A1、A3和A8适配体结合CD4+和CD8+ T细胞的混合T细胞群的流式细胞术检测图。b、CD8a siRNA沉默基因实验。C.利用CD8a- hnrnp - m - egfp质粒与Jurkat细胞成核24 h后，流式细胞术检测CD8a抗体和10nm RN、A1、A3和A8适配体与CD8+ Jurkat细胞的结合情况。左:流式细胞仪图,右图显示了GFP+ Jurkat细胞中抗体或适配体结合阳性的百分比。红色虚线水平线表示RN绑定的平均值。d.BLI检测CD8a蛋白与固定化的A1、A3和A8适配体结合实验，KD值的计算是通过对不同浓度CD8a蛋白的动力学数据进行1:1结合模型的全局拟合得到的。e. A1、A3和A8三种适配体与CD8+ T细胞的解离常数检测。
经一系列实验，本文证实三种适配体与人类CD8链亚型(CD8a)结合，通过BLI检测计算出CD8a蛋白与A1、A3和A8三条适配体的结合解离常数。又根据流式细胞仪做出三条适配体与CD8+ T细胞的结合曲线，并拟合得出解离常数，其中A3适配体和CD8+ T细胞结合最强。
Fig3|设计A3适配体的逆转剂。
为了使用基于适配体的亲和剂实现无痕细胞分选，在细胞释放步骤中需要一种逆转适配体与细胞结合的方法。本文采用互补的寡核苷酸链置换出细胞，因为它的优点是温和(与热或力相比)、高产量(与竞争性结合相比)和相对低成本(与核酸酶降解相比)。因此，本文通过适配体与互补的置换链(逆转剂)结合，从而和细胞分离开来。
Fig4|设计可逆转的基于适配体的选择策略从PBMCs中无痕无标记的CD8+ T细胞。a.使用A3t适配体对CD8+ T细胞进行无痕分选的示意图。生物素化适配体(5nm)预载于抗生物素磁珠上，然后和PBMCs孵育磁标CD8+ T细胞。将细胞悬液置于磁场作用下的LS柱上，在磁场作用下，将未标记的细胞从流过的部分中去除。保留在柱上的微球标记的CD8+ T细胞与100倍的补充逆转剂孵育，释放的CD8+ T细胞在RAE部分从柱上洗去。在没有磁场的情况下，用柱塞柱清除柱上的任何剩余细胞（CF）。b、流式细胞仪在标准的、基于抗体的磁分选(左)和无踪的、基于aptamera的磁分选(右)中不同部位的CD8检测情况。C.流式细胞术检测抗体磁分选CD8+T细胞冲洗部分(左)和aptamer磁分选CD8+T细胞RAE部分(右)中CD3和CD16的表达。d ef，流式细胞术检测两种方法分选的CD3+CD8+CD16 T细胞在不同部分的产量(d)、纯度(e)和CD8 MFI (f)。这些圆形、方形和三角形分别代表来自不同的捐赠者。
通过适配体A3及其同源逆转剂可以用来实现无踪迹的T细胞分选。CD8微球是目前唯一被批准用于临床规模CAR T细胞制造的选择技术。本文比较了基于适配体无痕分选T细胞方法和基于抗体的磁分选T细胞的产量，纯度和CD8荧光强度，发现适配体无痕分选的T细胞更纯。
Fig5|基于抗体和适配体分选策略的CD19 Car T细胞的特性研究。a，用分选的T细胞构建第二代携带EGFRt报告基因的CD19 CAR T细胞。b，流式细胞术检测在抗体和apamer分选的T细胞中EGFRt的表达。c，未转染的T细胞经磁分选后的生长状况。d，流式细胞术检测未转染的T细胞和CD19 CAR T细胞中Ki-67的表达。e，流式细胞术检测Mock细胞和CD19 CAR T细胞中PD1/TIM3/LAG3的表达。f，流式细胞术检测CD62L/CD45RA在mock和CD19 CAR T细胞中表达。g,h，体外Mock细胞和CD19 CAR T细胞的抗肿瘤细胞毒性和细胞因子释放素情况。
基于aptamer-和抗体-分选策略的T细胞在分选后几乎没有观察到差异，我们试图确认这个特点是否保持到最终的CAR t细胞产品。因此，本研究用基于抗体方法分选（CF部分）的T细胞和无痕的适配体分选 (RAE部分)的T细胞制造成CD8+ CAR T细胞，并充分比较了它们的生长状况、表型、基因表达和效应功能。结果表明适配体分选策略对CAR-T细胞没有任何持久的、长期的副作用。
Fig6|用抗体和aptamer分选的CD8+T细胞制作CD19 Car-T细胞进行肿瘤应激试验。用5 x105个CD19+ Raji细胞静脉注射到NSG小鼠中，7 d后用107个CD8+ mock或CD19 CAR T细胞进行处理。a.系统肿瘤的光子通量测量。b.Kaplan Meier生存曲线。黑色虚线表示50%的存活率，也称为中位存活时间。CD19 CAR t细胞治疗组的中位生存时间为:抗体:55 d;适配体:55 d. n= 9(每供体3只小鼠)。
尽管在体外实验中观察到基于抗体-和aptamer 分选策略制造的CD19 CAR T细胞的效应作用差异不大，但CAR T细胞的体外细胞毒性结果并不总是与体内结果一致，所以进一步证明其在体内的作用是必要的。通过继续观察发现在体内，两种方法分选的T细胞改造成的CD19 CAR T细胞具有近乎相同的抗肿瘤活性。通过肿瘤的光子通量测量的肿瘤回归和复发动力学及小鼠存活曲线，得出结论：在CAR-T细胞治疗的初始生产阶段，基于链置换的无痕适配体的细胞分选是一种可行的抗体磁分选的替代方法，其对最终细胞产品质量的下游影响可以忽略不计。
Kacherovsky, N., Cardle, I.I., Cheng, E.L. et al. Traceless aptamer-mediated isolation of CD8+ T cells for chimeric antigen receptor T-cell therapy. Nat Biomed Eng 3, 783–795 (2019). https://doi.org/10.1038/s41551-019-0411-6
