AJHG丨cfDNA片段化的基本生物学特征和过程

作者：张朝

近日，香港中文大学卢煜明教授团队在《美国人类遗传学杂志》（The American Journal of Human Genetics）发表最新研究成果，成功构建了cfDNA片段化模型，揭示了cfDNA片段化的两个主要步骤。这项研究阐明了控制cfDNA片段化和分子分布的生理因素问题，有助于优化当前的液体活检方案，以及为血液基础医学检测开发新方法。

cfDNA一直以来被认为是癌症等疾病诊断和预后的重要生物标志物，已有研究表明cfDNA以短片段的形式参与体液循环，但控制cfDNA片段化和分子分布的生理因素一直没有得到解决。卢煜明教授团队利用核酸酶缺陷小鼠模型构建了一个可以用来描述cfDNA片段化过程的模型，探索了三种酶（DNASE1，DNASE1L3和DFFB）在cfDNA片段化过程中的作用。通过对小鼠血液测序，并比较每种核酸酶缺陷型小鼠与野生型小鼠cfDNA分子，证明了该研究所选取的核酸酶均具有特定的切割偏好，解释了cfDNA片段化的过程。

图1. 研究方法概述

作者采用在EDTA中孵育全血的方法诱导细胞体外凋亡，模拟cfDNA片段化。如图1所示，通过EDTA孵育并对野生型小鼠血液样本进行测序，结果显示较长的cfDNA片段富集了A-end片段，而DFFB缺陷型小鼠血液测序则没有发现这种富集现象。由此作者认为，DFFB可能与A-end片段产生相关，即DFFB在细胞凋亡过程中DNA片段化中起重要作用。通过对DFFB酶的研究表明，DFFB在开放的核糖体间DNA区域中可产生钝的双链断裂，并且优先选择 A和G位点切割，进一步证实了由这种切割特征产生的cfDNA片段A-end富集现象。

作者进一步观察发现，如图2所示，实际样本中发现的典型cfDNA与EDTA孵育产生的cfDNA仍有较大差异，典型cfDNA片段更趋向于C-end片段，因此作者认为还有其它酶参与了cfDNA片段化过程，对A-end片段进行了进一步修饰。

图2. 典型cfDNA片段趋向于C-end片段

进一步研究发现，DNASE1L3缺陷型小鼠血液测序结果出现C-end富集现象。作者同时对比了DNASE1L3在循环系统中和在细胞内的作用，通过试验发现了cfDNA片段化的两个阶段：首先，DFFB和细胞内DNASE1L3以及其它凋亡核酸酶对凋亡细胞内的DNA进行切割，随后，血清中的DNASE1L3对释放到细胞外的DNA进一步片段化。在两个过程中，DNASE1L3均发挥了作用。

之后，作者对第三种酶DNASE1在cfDNA片段化过程中的作用也进行了研究。研究发现，野生型和DNASE1缺陷型小鼠的血液cfDNA片段几乎没有差异。通过用肝素模拟生物体内蛋白酶功能，进一步发现野生型小鼠DNASE1缺陷型小鼠血液样本中50-150 bp长度的T-end cfDNA片段增加，表明DNASE1可以切割产生长度＜150bp的cfDNA。

最后，作者认为所建立的cfDNA片段化模型包含了与cfDNA产生相关的一些关键核酸酶，但仍有一些可能参与的如核酸内切酶G、AIF、拓扑异构酶II和亲环蛋白等没有包括在内，无法完全模拟体内复杂过程，所以该模型还需进一步完善。此外，样本采集后的贮存条件、肝素等其他影响因素等都可能改变样本cfDNA的片段分布。

图3. cfDNA片段化模型

综上所述，如图3所示，cfDNA片段首先在 DFFB和细胞内DNASE1L3以及其他核酸酶作用下进行胞内切割，随后进行蛋白酶水解，之后，DNASE1可以进一步将cfDNA降解为＜150bp的T-end片段。这一过程将发现的核酸酶作用与实际观察到的cfDNA片段特征对应起来，阐明了cfDNA片段产生的基本生物学特征和过程。

Han et al. The Biology of Cell-free DNA Fragmentation and the Roles of DNASE1, DNASE1L3, and DFFB. The American Journal of Human Genetics. 2020, 106(2): 202-214.