NAT NANOTEC丨选择性器官靶向纳米颗粒用于组织特异性mRNA递送和CRISPR-Cas基因编辑

作者：徐雪梅

基于mRNA的蛋白质替代疗法和CRISPR-Cas基因编辑在有效治疗多种细胞来源的致病突变方面具有巨大的潜力。由于突变蛋白是在特定细胞中产生的，因此迫切需要开发靶向器官的传递策略，以充分发挥基因药物的潜力。尤其在活体应用中，若能选择性靶向某种器官并进行基因编辑或者mRNA的递送将对靶向治疗产生重大意义。当然，无论是mRNA或是基因编辑元件的递送仍不可避免地需要某种载体。非病毒的合成纳米颗粒是一种相对安全有效的递送药物的载体，如脂质载体、无机材料载体、生物材料载体等。在现有的递送载体中，脂质纳米颗粒（LNPs）是一类可以将治疗性核酸输送到肝脏的广泛运用的材料，但是目前仍然不可能预测及合理地设计纳米颗粒，将负载物输送到肝脏以外的组织，即靶向肝脏以外的器官的纳米颗粒载体的合成仍然存在一定的挑战。

在本篇文章中，肺、脾和肝脏器官靶向的脂质纳米颗粒被系统地设计合成用于选择性治疗和编辑相关的细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、B细胞、T细胞和肝细胞。作者利用大量的实验证明，选择性器官靶向（Selective Organ Targeting，SORT）脂质纳米颗粒可以有效地递送mRNA至特定的器官中，而且能够靶向地兼容递送多种基因编辑元件，包括mRNA、Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9核糖核蛋白复合物（RNP），此技术有望推动靶向组织中帮助蛋白质替代和基因纠正治疗的发展。

作者报道的这种SORT策略，通过系统地设计纳米颗粒，使其作为载体在静脉注射后可以将包括mRNA、Cas9 mRNA/sgRNA和Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物在内的多种物质准确地输送到小鼠的肺、脾和肝脏。传统的LNPs由可电离的阳离子脂质、两亲性磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质组成。通过在这些传统的LNPs中添加一种补充成分（SORT分子）精确地改变了体内RNA的传递曲线，并介导了组织特异性基因的传递和编辑。这种器官靶向性是根据SORT分子的百分比和生物物理性质来介导组织特异性释放。

如图1a所示，在传统的LNPs中加入某种SORT分子，使其特异性靶向至某种器官。以5A2-SC8 LNPs为基本脂质纳米颗粒，当加入的SORT分子（DOTAP，永久正电性脂质）比例为0时，即单纯的mDLNP纳米颗粒（负载Luc mRNA）在肝脏处聚集并大量表达Luc蛋白；当DOTAP比例逐渐增加时，Luc蛋白的表达逐渐向脾（10-15 %）和肺（40-50 %）转移（图1b）。当加入的SORT分子（18PA，永久负电性脂质）比例为5-40 %时，Luc蛋白仅在脾中表达，在任何其他的器官中均没有表达（图1e）。同样地，以DLin-MC3-DMA LNPs为例，MC3 LNPs负载的Luc mRNA绝大部分在肝脏中表达，当加入50% DOTAP分子时，Luc mRNA仅在肺中表达，印证了b实验，当加入30% 18PA分子时，Luc mRNA仅在脾中表达，印证了e实验，以C12-200 LNPs为例亦有同样的结果（图1f），这些实验证明SORT分子的加入有效地实现了选择性器官靶向的mRNA递送。

图1. 选择性器官靶向脂质纳米颗粒的器官靶向功能验证。（a）SORT LNPs合成及靶向示意图。（b）mDLNP作为载体，被递送的Luc mRNA只在肝脏中表达。随着DOTAP比例的增加，Luc mRNA的表达从肝脏到脾脏再到肺部。（c）Luc mRNA在三种器官中的表达量的统计柱状图。（e）当18PA的比例为5%-40%时，Luc mRNA仅在脾脏中表达。（f）MC3纳米颗粒负载的mRNA仅在肝脏中表达，当DOTAP分子的比例为50%时，DLin-MC3-DMA SORT LNPs递送的mRNA仅在肺部表达；当18PA分子的比例为30%时，DLin-MC3-DMA SORT LNPs递送的mRNA仅在脾中表达。对于C12-200纳米颗粒，结果类似。（g）各种纳米颗粒的分子组成及比例列表。

为了探究所观察到的组织取向分布是特定于精确的化学结构还是适用于特定的化学类别，作者评估了多种永久性阳离子（DDAB、EPC）、阴离子（14PA、18BMP）、两性离子和可电离阳离子类脂（DODAP、C12-200）的SORT特性。如图2所示，以5A2-SC8 LNPs为基本脂质纳米颗粒，当此LNPs包含5, 15, 40, 50, 100%的DDAB或者EPC分子时，Luc mRNA的表达行为与DOTAP类似，均是从肝脏到脾再到肺（图2a）。14PA和18BMP属于永久性阴离子类脂，但是具有非常不同的化学结构，实验发现，这两种SORT分子均使得LNPs靶向至脾，与18PA分子类似（图2b）。然而，DODAP和C12-200这种可电离阳离子类脂却不能使LNPs具有组织倾向性，但是会使mRNA的表达在肝脏中大大增强，20%的DODAP的加入会使mRNA在肝脏中的表达达到饱和（图2c）。而且，SORT LNPs负载的mRNA的表达量与mRNA的剂量有关。以表达hEPO蛋白的mRNA为负载物，20% DODAP LNPs为载体，发现肝脏中hEPO蛋白在注射SORT LNPs 6h后达到最高值，且hEPO的表达能够持续一周以上（图2e）。静脉注射肺、脾、肝靶向型LNPs和MC3 LNPs后，用ELISA法测定血清中hEPO的含量，发现LNPs携带的mRNA量越大，hEPO蛋白的表达量越多。与单纯的MC3 LNPs载体相比，加入SORT分子的LNPs载体具有明显的靶向器官的能力（图2f）。同样地，以SORT LNPs策略递送表达IL-10蛋白的mRNA，也具有同hEPO类似的结果（图2g）。

图2. SORT依赖于生物物理特性，而不是精确的化学结构来递送治疗编码相关蛋白的mRNAs。（a）永久性阳离子类脂（DDAB、EPC和DOTAP）在一定的比例下会使SORT LNPs携带mRNA更倾向于递送至肺。（b）阴离子类脂（14PA，18BMP，18PA）在一定的比例下会使SORT LNPs携带的mRNA更倾向于递送至脾。（c）含三级氨基的可电离阳离子类脂（DODAP，C12-200）会有效地增强mRNA向肝脏递送。（d）条件优化的选择性靶向器官的分泌蛋白的mRNA递送方案示意图。（e）肝脏（20% DODAP LNPs）中hEPO蛋白的表达量随注射时间的变化曲线图。（f）静脉注射肺、脾、肝靶向型LNPs和MC3-LNPs后，用ELISA法测定血清中hEPO的含量。（g）以mCherry mRNA分型和PBS为对照，静脉注射肺、脾、肝靶向型LNPs和MC3-LNPs后，用ELISA法测定血清中IL-10的含量。

为了检验和量化SORT LNPs类纳米颗粒介导器官特异性基因编辑的能力，作者利用基因工程tdTom报告小鼠，该小鼠含有一个阻止tdTom蛋白表达的LoxP侧翼停止盒。一旦停止盒被删除，tdTom基因被激活，tdTom蛋白表达的能力被打开，以此方式检测基因编辑的细胞（图3a）。作者最初利用SORT LNPs递送Cre mRNA，它能产生Cre蛋白，并删除编辑细胞中激活tdTom的停止盒。20% DODAP分子的加入使得mDLNP靶向至肝脏，50% DOTAP SORT分子使得LNPs靶向至肺（图3b）。对于tdTom老鼠来说，与其他器官相比，这些小鼠脾脏的背景器官自身荧光较弱，需要使用单独的对照（图3c），这使得脾脏特异性的检测更具挑战性。然而，使用组织切片的共聚焦成像很容易看到tdTom阳性细胞（图3d）。20% DODAP SORT LNPs递送使得93% mRNA均在肝脏中表达，脾靶向型LNPs（30 % 18PA）能够转染约12 %的B细胞、约10 %的T细胞和约20 %的巨噬细胞（图3e）。由于选择性的提高，脾脏靶向型LNPs可用于治疗非霍奇金B细胞淋巴瘤和其他免疫疾病。

图3. SORT LNPs通过递送Cre-mRNA来激活组织特异性的tdTom基因。（a）通过Cre介导停止盒基因缺失，LNPs携带Cre mRNA的递送激活tdTom转基因小鼠的tdTom基因的表达的示意图。（b）mDLNP、肝靶向性的SORT LNPs（20% DODAP）和肺靶向性SORT LNPs（50% DOTAP）诱导tdTom基因在靶向的组织中的选择性基因编辑。（c）脾脏靶向型LNPs（30% 18PA）诱导脾脏基因编辑。（d）器官靶向性基因编辑后对各种组织切片后进行共聚焦显微镜成像，观察tdTom荧光。（e）流式细胞分析用于定量肝、肺、脾等器官的细胞类型中tdTom+细胞的百分比。

接下来，作者通过静脉注射携带Cas9 mRNA和sgRNA的SORT LNPs来实现组织特异性CRISPR-Cas基因编辑（图4a），通过切除stop基因来激活tdTom基因，表达tdTom蛋白。mDLNP和20% DODAP SORT-LNPs靶向至肝脏中特异性地诱导tdTom表达，50% DOTAP SORT-LNPs将mRNA递送至肺中进行stop基因切除，诱导tdTom的表达（图4b）。将器官靶向性的基因编辑后的组织切片进行共聚焦成像，也可以直观地观察到tdTom蛋白的高表达（图4c）。Cas9 mRNA和sgPTEN负载在LNPs中共转染后选择性地编辑C57/BL6小鼠的肝、肺和脾。利用DNA测序和TIED分析三种器官中基因编辑效率，发现被靶向的器官的细胞中存在被编辑切割成两段的DNA片段（图4d）。H&E切片和IHC成像，清晰透明的细胞质图像显示在H&E切片中脂质的堆积和IHC成像中PTEN的丢失，进一步证实PTEN基因编辑的成功（图4e）。

一般认为，负载RNP复合物比直接负载Cas9 mRNA和sgRNA相对较难。用7% DOTAP或55% DOTAP LNPs分别负载Cas9/sgTom1-RNP复合物，靶向递送至肝和肺，切除肝和肺的stop基因，从而诱导tdTom的表达（图4f）。肝和肺靶向性LNPs用于递送Cas9/sgPTEN RNP复合物，以选择性编辑C57/BL6小鼠的肝和肺。T7E1和TIDE分析表明，组织特异性PTEN编辑成功（图4g）。静脉注射9天后，T7EI分析表明PCSK9基因被编辑成功以及编辑效率约为60%。Weston blot分析PCSK9蛋白在肝脏和血液中的表达下降了约100 %。

图4. 转染Cas9-RNPs和共转染Cas9 mRNA和sgRNA对tdTom转基因小鼠和C57/BL6野生型小鼠组织特异性CRISPR-Cas基因编辑的影响。（a）Cas9 mRNA（或Cas9蛋白）和sgTom1的共递送激活tdTom转基因小鼠的tdTom表达的示意图。（b）mDLNP和SORT-LNPs（20% DODAP）在肝脏中特异性地诱导tdTom表达，肺靶向的SORT-LNPs（50% DOTAP）特异性地在肺中进行stop基因切除，诱导tdTom的表达。（c）器官靶向性的基因编辑后的组织切片进行共聚焦成像。（d）Cas9 mRNA和sgPTEN负载在LNPs中共转染后选择性地编辑C57/BL6小鼠的肝、肺和脾。（e）H&E切片和IHC成像。（f）7% DOTAP或55% DOTAP LNPs分别负载Cas9/sgTom1-RNP复合物，靶向递送至肝和肺，切除肝和肺的stop基因，从而诱导tdTom的表达。（g）肝和肺靶向性LNPs用于递送Cas9/sgPTEN RNP复合物，以选择性编辑C57/BL6小鼠的肝和肺。（h）用20% DODAP-SORT-LNPs递送Cas9 mRNA和sgPCSK9至C57BL/6小鼠。（i，j）静脉注射9天后，T7EI分析表明PCSK9基因被编辑成功。（k，l）Weston blot分析PCSK9蛋白在肝脏和血液中的表达下降了约100 %。

总结：选择性器官靶向性方法的发现，使得RNA纳米颗粒可预测地递送至特定器官，有望推送蛋白质替代和基因矫正疗法的发展。由于传递效率与SORT分子类别密切相关，该方法可广泛应用于现有的LNPs和其他纳米颗粒系统。但是目前，这种方法的机理还有待进一步完善研究，更进一步的靶向递送的普适性也有待进一步的开发。

Qiang Cheng , Tuo Wei , Lukas Farbiak, Lindsay T. Johnson , Sean A. Dilliard, Daniel J. Siegwart. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing. Nature Nanotechnology, 2020, doi: 10.1038/s41565-020-0669-6.