JACS丨强制插层的适配体（FIT-适配体）
作者：晁丹丹
适配体是一类可以识别不同靶标物质的核苷酸序列。FIT-适配体是指在适配体序列中，其中一个碱基被喹啉蓝（D）所替代，那么，当适配体与靶标物质相互作用时，便强制性的引发染料在核苷酸碱基对之间进行插层，从而改变D的分子构象，发出荧光（如图1）。由于FIT-适配体可以通过分子内构象变换，类“三明治”结构排列以及以靶标物为模板的分裂适配体重交联等方法检测适配体与靶标物的准确结合，因此其可应用于多种反应机制的适配体特异性识别。除此之外，相对于荧光剂-猝灭剂体系，FIT-适配体可以减少假阳性信号；相对于能量共振转移为基础的探针，它能提供高达15倍的信噪比。同时，它还可在复杂的体系如人类血清中进行快速灵敏的靶标物检测，通常可达到微摩尔级别。
图1 FIT-适配体:由D修饰的适配体与靶标物结合时发生构象变化，从而发出荧光
首先，为了证明FIT-适配体识别靶标物的可行性，作者首先选用了T14核苷酸序列，其中靠近5’端的第四个碱基被D取代(如图2所示)。由于Hg2+能够特异性指导T碱基并在两个T碱基之间形成T- Hg2+-T架桥连接，当体系中出现Hg2+时，单链T14探针必会形成发夹结构，使得D强制性地插层在碱基对之间，从而产生荧光。同时，其具有很高的灵敏度，当Hg2+浓度为250 nM时，体系的荧光值可提升20倍左右。此种方法同样适用于检测Ag+,它可特异性指导C碱基形成C- Ag+-C结构。
图2FIT-适配体检测Hg2+。（A）设计方案；（B）荧光增加值随Hg2+浓度的变化曲线。
（C）随着Hg2+浓度的增加，体系的荧光光谱变化曲线；（D）所选用探针的选择性。
进一步地，为了验证此方法在适配体与靶标物结合时产生的更为复杂的结构转变过程中，FIT-适配体检测的可行性，作者以i-motif为例进行了系列研究。由于该结构在H+的调控下,会以C-H+-C键相互连接形成四链结构。因此，在酸性条件下i-motif是一种C碱基丰富的“质子-适配体”。如图3所示，当体系pH由7降至5.4时，由于含有D的C14序列形成i-motif结构，导致D在碱基对之间插层，构象发生变化，从而产生荧光。
图3 FIT-适配体检测H+.（A）设计方案；（B）圆二色谱证明了i-motif结构在较低的pH下形成；（C）各体系的荧光增长值随pH的变化情况。
最后，作者通过利用FIT-适配体来检测凝血酶，进一步证明了该方法的多样性。之所以选用凝血酶，是因为适配体结合其表面两个不同的位点对其进行特异性识别。如图4所示，两个独立的适配体，其中一个被D修饰,在与凝血酶特异性结合的过程中，两个独立的适配体相互靠近，局部浓度提高，进而相互杂交。D便插层于碱基对之间，分子构象变换，从而产生荧光。
图4 FIT-适配体检测两个抗原共同识别抗体。（A）设计方案；（B）体系荧光强度的提高程度随凝血酶浓度增长而产生的变化情况；（C）探针的选择性
相对于荧光剂-猝灭剂体系及以能量共振转移为基础的探针等荧光检测体系，该研究直接在适配体合成的过程中引入荧光染料，不仅使适配体特异性识别靶标物变得多样化，简单化，并且从反应动力学上，使得检测过程更加灵敏化，大大降低了信噪比。
Sasha B. Ebrahimi, Devleena Samanta,Ho Fung Cheng,Levy I. Nathan,and Chad A. Mirkin. Forced Intercalation (FIT)-Aptamers. J. Am. Chem. Soc.2019, 141(35), 13744-13748. DOI: 10.1021/jacs.9b06450
