NAT CHEM丨可编程自主合成单链DNA

作者：秦振恒

DNA是生命的信息载体，对基因中各种功能分子的指令进行编码。DNA也是纳米技术中的基础元素，并被用于构建纳米结构、动态电路和器件。DNA也被广泛应用于生物技术，如生物传感器、序列扩增、基因编辑甚至记忆储存。

尽管DNA在生物学、纳米技术和生物技术中的应用多种多样，但目前可对于可编程自主合成ssDNA序列是受限的。其需要额外几个外部步骤在每一个使用特定化学条件的分阶段过程通过非自组装的方法合成DNA寡核苷酸。酶驱动的方法，如聚合酶链式反应（PCR），环介导的等温扩增（LAMP），链置换扩增术（SDA），滚环扩增（RCA）和聚合酶/核酸外切酶/切刻酶（PEN）通常仅限于产生固定序列的相同扩增产物。

来自哈佛大学的尹鹏教授课题组在国际学术期刊《自然-化学》（Nature Chemistry）上发表重要论文《Programmable autonomous synthesis of single-stranded DNA》描述了一种基于Primer exchange reaction（PER）可编程自主合成单链DNA的方法。

PER合成是以一种可编程、自主的、原位和可以和环境交互的反应，为工程分子电路和器件提供了一个平台，具有广泛的传感、检测、记录信号处理和驱动能力。作者在实验上展示了一种纳米器件，其能够将检测到的触发RNA转化被DNA酶降解的底物，这是一种信号放大器，只有在特定RNA信号存在时才有可能合成长的荧光链，即分子计算电路，用于评估RNA输入的时间分子事件的逻辑组合（AND，OR，NOT），通过PER反应记录不同RNA输入和被检测的顺序。

PER反应从特定的DNA引物开始。使用DNA发夹催化，然后在现有的引物上加一个用户指定的独立的一个新的引物（这就是一个链置换反应）。新扩增的引物能够触发下一步扩增，从而按规定的方向形成可编程的PER级联反应，按照用户指定的路径生长出一条新生的DNA单链（图1.A）。

当且仅当正确的发夹和相应的引物共存时，一条新的链就会在原位自动产生。这条链可以被用户编程任意指定的序列，它可以充当上面描述的许多功能角色，提供了一种可编程的原位控制/传递这些功能的方法。此外，通过将每个发夹与外部元素连接，这些每一个功能性反应都可以编程为对不同环境线索做出的反应。（例如，存在或缺少某些生物分子的组合，如microRNAs；图.1B-E）。这种反应灵敏的合成方法可用于实现针对特定环境背景的分子行为检测，使可编程动态分子电路具有广泛的分子传感、检测、记录、信号处理和驱动的能力。

图1. PER概述。A，PER级联反应按照所描述的序列合成ssDNA。B，一个纳米装置合成的具有功能性的DNA酶能够切割转录产物，该转录产物只有在miRNA信号输入的情况才会产生。C，PER可以用作荧光信号放大器用来检测特定RNA的存在。D，PER逻辑计算，它基于一个逻辑表达式来测定那种RNA的存在。D，一种分子程序，记录DNA转录两种信号的先后顺序。

    一个PER反应对应一个催化的发夹结构（图2.A），催化发夹将所需的序列（b序列）附加在引物a后边。图2.C描述了PER反应的整个循环，第一步，引物a和发夹的3’和引物a互补的a*序列结合。在链置换聚合酶的存在下，引物a以b序列（该区域称为发夹复制区域）为模板进行延伸，遇到终止序列延伸停止（第二步）。新和成的b可以和发夹上的b以三向分支迁移的随机行走方式进行竞争（第三部）。带新和成b的引物从发夹上脱落（第四步）。催化发夹然后在另外一个PER中和引物反应。在本文实验中，采用了7-9个碱基长度的引物，确保其在第一步和第二步中发挥引物功能，同时在37℃下第四步能够及时解离。

每个PER反应都含有终止序列用来终止聚合反应。例如本文中是G-C碱基对（图2.B），序列a和b由三种碱基组成As, Ts 和Cs，dGTP被排除在外，如果终止序列包括化学修饰，其就能合成由四种碱基的序列。发夹结构3’端修饰inverted dT为了防止未结合的引物5‘端的延伸。

图2.  PER反应机制。A，PER使用一种催化发夹进行反应的。B，一个采用G-C序列作为终止序列的PER反应例子。C，一个PER反应循环。D，PAGE变性凝胶显示了PER反应时间梯度变化。引物和发夹浓度分别为100 nM 和1 nM，反应条件在37 °C ， dATP, dTTP 和dCTP各自10 µM。

图3.  PER级联反应。A，引物序列自动逐步延伸原理图。B，五个延伸步骤的反应图，由发夹A、B、C、D和E。C，变性凝胶显示不同在不同发夹集合存在下的不同延伸，反应是在37°C孵育4h，引物100 nM,发夹10 nM和dATP 、dTTP、dCTP 各10µM。D，平行合成40个ssDNA用于组装DNA折纸的原理图，AFM图显示得到了预期的DNA折纸。

此外，PER级联反应只有当遇到特定的分子触发器时可编程才会被起始。利用此特性将构造一种PER纳米装置，其能够在特定RNA存在时降解RNA。具体，这种纳米装置检测到致癌miRNA19a信号，随后编码合成了能够被DNA酶切割的RNA底物。对于此应用，一对合成的核苷酸，iso-dG和iso-dC被用作为终止序列（图4.B）,这使得在接下来合成中使用所有的四种碱基序列。

图4.  PER纳米装置应用于条件降解RNA。A，纳米装置的原理图，它能够检测一个miRNA靶标并切割一个独立的转录RNA。B，合成核苷酸，iso-dG和iso-dC，用作四碱基编码合成的终止序列。C，致癌miRNA19a序列触发合成DNA酶识别的底物序列。DZ-TWT和miRNA靶标的序列。D，PAGE变性凝胶验证miRNA和Twist mRNA片段在孵育溶液中生成不同的发夹状态。

接下来，作者建立了一个单发夹系统，可以合成长股重复序列（图5.A），被称为合成的‘端粒酶’，在检测特定的miRNA输入，使用这种结构作为信号放大器。

图5.  PER信号放大器。A，用一个发夹来实现一个合成‘端粒酶’的示意图。B，PAGE变性胶显示不同发夹浓度下的端粒化。C，信号放大原理图，miRNA靶标激活荧光端粒酶链的合成。D，信号放大器的示意图和系统组分，门控发夹A和端粒发夹B被设计用来对miRNA的信号检测做出反应。E，PAGE凝胶显示条件端粒化的各片段组分。

PER简单地通过编程，那些引物序列上附加目标序列与否，可用于实现任意序列的AND、OR和NOT逻辑编程。基本策略是用门控发夹平衡靶标RNA，读出在凝胶电泳上长度结果。

图.6  使用PER进行逻辑计算。A，用RNA输入计算表达式的运算原理图。B-D，三种分子计算逻辑门。E，一个由三种逻辑组成的程序,通过PAGE凝胶电泳显示特定RNA信号的输入。

接下来作者创建了一个时空对序列进行编码的分子事件记录系统，动态记录两个靶标RNA相遇的顺序。

图.7  PER反应应用于时空顺序记录器。A，记录事件的原理图，PER转录对应不同时间的RNA信号。B，时间记录器的系统组成和反应图。采用四种门控发夹（A、B、C、D）编程合成不同的发夹对两个靶标RNA的不同顺序相应。C，PAGE凝胶电泳显示不同片段，不同片段顺序记录两个靶标RNA的反应顺序。

PER以自组装和逐步的方式动态合成任意指定的DNA序列。在均相等温扩增条件下，PER可编程级联反应由催化发夹进行催化，在dNTPs的推动下由聚合酶驱动反应。PER允许任意序列串联成所需转录本，反应可以简单地级联生成指定的合成途径，而且合成则可以对当前的环境条件作出应答。总之，这些特点使得PER反应称为一个通用的可编程平台，该平台可以实现对不同环境分子行为（如RNA降解物，原位信号放大器，RNA逻辑计算和时空顺序记录器）进行响应。

 Kishi, J.Y., et al., Programmable autonomous synthesis of single-stranded DNA. Nat Chem, 2018. 10(2): p. 155-164.