NAR | 结构缺陷的G四链体在转录调控中的潜在作用

大家好！今天分享的是一篇于2025年3月发表在Nucleic Acids Res.上的论文，题目为“Imperfect G-quadruplex as an emerging candidate for transcriptional regulation”，通讯作者为日本甲南大学的Naoki Sugimoto，研究方向包括核酸化学、非典型核酸结构及其在疾病治疗中的应用。

本研究系统设计并分析了带有不同bulge特征的buG4结构，明确了bulge位置、类型和长度对G4稳定性和功能的调控规律。通过体外转录实验，作者发现稳定性较高的buG4能够有效阻止RNA聚合酶延伸，并且buG4结构的稳定性与其转录功能之间存在良好的相关性，因此研究建立了基于热力学自由能（）的预测模型，界定了具有转录抑制功能的buG4标准，并通过体外转录实验验证。此成果首次证明了“不完美G4”作为新型转录调控单元的潜力，为识别、筛选及靶向功能性G4-like结构提供了理论依据与技术路径（图1）。

图1. 图文摘要

一、研究背景

G-quadruplex（G4）是由鸟嘌呤堆叠形成的四链结构，广泛存在于启动子、编码区等关键基因区域，在复制、转录、翻译等过程中发挥重要作用。生信分析发现，大量G4类似序列存在不完美的bulge G4（buG4）结构（图2C），即G-轨道中插入非G碱基形成“凸起”（bulge）结构。确认buG4结构的稳定性和功能，有望成为新的基因表达调控单元，也可能成为疾病治疗的新靶点。

图2. （A）G4序列中G-片段的示意图。（B）pG4结构示意图。（C）一个带有1号位置bulge的buG4结构示意图。

二、研究结果

1.buG4稳定性分析

本文以经典pG4序列为模板，系统引入单一bulge突变，设计了不同类型（A、C、T）、不同位置（第1至第8位）和不同大小（1-7 nt）的buG4变体。作者通过热力学分析显示，bulge的类型、位置及长度均会影响G4稳定性，其中A型bulge导致的ΔTm降低最大（ΔTm ≈ –8°C），稳定性破坏程度高于C型和T型bulge。5'端（第1位）bulge对结构扰动最小，稳定性较高（ΔΔ≈ 2.3 kcal/mol），而3'端bulge导致的去稳定化效应更为显著，稳定性较低（图3）。

图3. 在不含PEG 200的非拥挤条件下（A）和含PEG 200的拥挤条件下（B）pG4和单个bulge的buG4s的UV熔解曲线。（C）不同位置的bulge在非拥挤和拥挤条件下的自由能变化图。

此外，随着bulge长度增加（＞5 nt），buG4稳定性进一步下降，尤其在非拥挤条件下，7nt bulge几乎无法形成稳定四链体。但在PEG200分子拥挤环境中，较大bulge（如6-7 nt）结构的稳定性得到一定程度的恢复（图4）。

图4. 在非拥挤（A、C）和拥挤（B、D）条件下，在位置1处不同bulge长度的buG4s的紫外熔解曲线

2. buG4对转录的影响

为评估buG4在转录过程中的功能，作者构建了包含pG4或不同bulge位置和长度的buG4插入片段的DNA模板，并在体外使用T7 RNA聚合酶进行转录实验。实验结果表明，pG4模板几乎完全抑制转录，而不同bulge位置的buG4亦可抑制转录，尤其是bulge位于5'端（位置1）的变体（抑制率>80%），而bulge位于3'端（如位置8）则转录抑制效果减弱，完整转录产物比例上升（图5），这可能是因为bulge靠近模板3'端，难以在转录早期形成稳定buG4。此外，部分中间位置bulge（如位置7）的电泳凝胶图显示具有中等长度的转录抑制产物条带，提示buG4结构可能存在折叠动态或中间态。

图5. （A）模板DNA序列。（B）含有pG4和单个凸起buG4的模板DNA的变性电泳凝胶图。（C）含有pG4和单个凸起buG4的模板DNA的转录停滞效率。

作者分别用含在pG4上层和下层不同的位点具有不同长度bulge的buG4进行体外转录实验后，发现bulge的长度越长，所形成buG4对转录抑制作用越弱（图6），说明含有较长bulge的buG4稳定性更差，这与前面的热力学稳定性数据一致。

图6. （A）G4结构中bulge位置分为上下层。在拥挤条件下，含有bulge在位置1（B）、位置3和5（C）、位置4和6（D）以及位置8（E）处的模板序列的转录产物的变性凝胶电泳结果图。（F）每种模板DNA在拥挤条件下的转录停滞效率。

3. 模型建立与预测体系开发

基于热力学和转录实验数据，作者进一步建立了评估buG4功能性的预测体系。buG4结构的稳定性与其转录功能之间存在良好的相关性，其中稳定性由37℃下的自由能变化定义。通过回归拟合，确定≤ -3.3 kcal/mol为有效功能性buG4的界限标准，即只有稳定性达到该阈值的buG4，才能有效抑制RNA聚合酶延伸（TE arrest＞10%）。反之，
＞-3.3 kcal/mol的buG4则判定为没有转录抑制作用（TE arrest<10%）（图7）。该模型为快速筛选功能性buG4序列提供了简便、实用的判别标准，未来可应用于基因组范围内功能性G4-like结构的识别与靶点筛选。

图7. （A）buG4序列的稳定性与转录抑制效率之间的关系。（B）使用建立的预测方程，筛选具有良好稳定性并可有效抑制转录的buG4候选序列的策略示意图。

为了验证该模型的普适性，作者进一步选取了MYC、KIT、KRAS和PARP1等癌症相关基因中的天然buG4序列。实验结果显示，符合≤ –3.3 kcal/mol标准的序列，如KRAS-bT1-4（= –7.1 kcal/mol），表现出明显的转录抑制（TE arrest = 39.8%）；而> -3.3 kcal/mol的序列，如KIT-bT1-5（ = –1.5 kcal/mol），转录抑制能力不足，与预测结果相符合（表1）。

表1. 人源buG4序列的稳定性与转录抑制效率分析

总结：

作者系统设计并表征了带有bulge结构的buG4s，提出buG4作为新型转录调控单元的概念。通过调控bulge的位置、类型和大小，建立了一套稳定性与功能性相关的评价体系，并以为核心参数，开发出一套可预测buG4转录抑制能力的模型。研究进一步扩展至癌症相关基因（如KRAS、MYC等）中的天然buG4结构，验证了≤–3.3 kcal/mol标准在生理相关序列中的适用性。考虑到G4及其变异结构在基因表达和疾病中的重要作用，这一研究为探索和干预G4相关生物学过程提供了新的理论框架和潜在策略。

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