Nature Communications | 单剂量抗肌红蛋白 RabMAb 的阻断策略挽救RM/CS-AKI

大家好，今天分享的文献是2025年1月发表在Nature Communications上题为Rescue RM/CS-AKI by blocking strategy with one-dose anti-myoglobin RabMAb的研究论文。

通讯作者：

本文的作者是来自天津大学卫生应急学院的龚燕华教授，该课题组近年来主要致力于应急医学领域灾难事故相关特殊创伤（地震挤压伤、爆炸冲击伤等）炎症免疫机制与生物救治技术研究。

研究背景：

横纹肌溶解症或挤压综合征相关的急性肾损伤（RM/CS-AKI）具有极高的发病率和死亡率，已成为临床亟需解决的重大挑战。全球每年仍有数百万人因地震、塌方、交通事故、战争等灾难性紧急事件遭受横纹肌损伤，其中许多病例最终发展为CS-AKI。同时，在日常生活中，非创伤性RM更为常见，其诱因包括毒品滥用、酒精中毒、剧烈运动及高热等，均可引发严重的RM-AKI。RM/CS-AKI 的主要致病机制在于肾毒性肌红蛋白（Mb）在肾小管中的大量积聚。正常情况下，Mb 等血红素类物质可通过与血浆中的血红素结合蛋白（hemopexin 或 haptoglobin）结合被清除。然而，当血液中游离肌红蛋白浓度急剧升高，超过这些结合蛋白的清除能力上限时，未结合的Mb便在肾组织中累积，诱发急性肾小管损伤、管型形成和氧化应激反应，最终导致AKI。尽管 RM/CS-AKI 的病理机制已得到广泛认识，但目前在现场或灾难应急情况下仍缺乏切实有效的早期干预手段，这严重限制了患者的救治效率与生存率。

整体设计：

抗体疗法是针对致病因素实现因果治疗的理想选择。多项针对小动物水平的临床前探索研究采用抗体（anti-RAGE, anti-HMGB-1）来对抗挤压伤后全身炎症反应因子所发挥的功能。然而，在横纹肌溶解后释放的最重要的肾毒性伤害因子（Mb）并未被直接中和或对抗。因此，作者提出创建一个“移动屏障”的概念，以保护肾小球滤过屏障：Anti-Mb RabMAb（约150 KD）与血液循环中的游离Mb（约17 KD）结合形成免疫复合物，这些大型免疫复合物将无法通过肾小球滤过屏障的主要膜孔（约69 KD），从而物理性地阻挡Mb的肾毒性。

图1. Anti-Mb RabMAb治疗RM/CS-AKI的示意图。

结果与讨论：

1.动物模型验证疗效

为了验证他们的构想，他们首先进行了动物模型中的疗效验证。作者构建了RM以及CS相关AKI模型（图2a），在RM/CS-AKI模型兔中出现了严重的红色尿液（图2b，c），而在注射Anti-Mb RabMAb 24小时后，处理组表现出显著缓解。此外WB结果显示大量肾毒性Mb在RM/CS-AKI 模型兔的肾脏中积累，而Anti- Mb RabMAb 组大鼠肾脏中Mb的含量显著降低（图2d，e）。同时，免疫组化实验显示RM/CS-AKI 组的肾小球和肾小管中形成明显的Mb管型，而这些现象在Anti- Mb RabMAb 组中得到显著缓解（图2f，g）。并且，与RM/CS-AKI 组相比，Mb RabMAb组血清和尿液中BUN、Cr、CK 和 Mb的含量明显降低，表明肾损伤和功能得到显著改善（图2h-o）。此外，Anti- Mb RabMAb 组的肾小球滤过率（GFR）显著增加，肾功能得到改善（图2p-r）。以上结果表明Anti-Mb RabMAb可以减轻RM/CS-AKI模型兔的肾损伤。

图2. 使用Anti-Mb RabMAb 拯救中型动物RM/CS-AKI 模型兔

为了进一步验证疗效，作者进一步在异源RM/CS-AKI模型小鼠中进行Anti-Mb RabMAb治疗。可以看到RM组或CS组在建模后72 h的小鼠存活率约为25%或5%，而Anti- Mb RabMAb组的存活率分别约为90%或75%（图3b，c），并且与RM/CS-AKI组相比，Anti- Mb RabMAb组肾损伤标志物NGAL的表达水平和肾脏中Mb的含量降低（图3d，e）。同时，在近端肾小管中，Anti-Mb RabMAb组经LTL（可特异性标记刷状缘的染料）标记的刷状缘所勾勒出的Mb染色区域，相较于急性肾损伤（RM/CS - AKI）组和急性肾损伤（RM/CS - AKI）+磷酸盐缓冲液（PBS）组显著减少（图3f，g）。此外，与RM/CS - AKI组相比，Anti - Mb RabMAb组在24小时和72小时时的肾小球滤过率（GFR）显著升高，这表明肾功能有明显改善（图3l - s）。总体而言，抗Mb RabMAb可以通过中和血液中的游离Mb来减少肾小管中的Mb含量，从而减轻肾损伤，改善肾功能，并提高RM/CS-AKI模型小鼠的生存率。

图3. 使用Anti-Mb RabMAb拯救异源RM/CS-AKI模型小鼠

2.Anti-Mb RabMAb减轻肾损伤的机制

根据RM/CS-AKI的发病机制，作者使用来自小鼠的永生化肾小管上皮细胞（TCMK-1细胞）以模拟RM/CS-AKI的细胞模型，从而对Anti-Mb RabMAb减轻肾损伤的作用机制进行探究。免疫荧光结果显示，与Mb和Mb + IgG组相比，Mb + Ab组在TCMK-1 细胞中的Mb积累显着降低（图4f）。这些结果表明，Anti-Mb RabMAb 可以快速中和细胞外Mb，从而阻止其进入TCMK-1细胞并阻断其毒性。但是，Anti-Mb RabMAb 在体内捕获游离Mb后形成的免疫复合物去了哪里呢？单核巨噬细胞在体内清除了吗？为了回答这个问题，作者使用具有巨噬细胞的多种特性的RAW 264.7细胞进行了探究。免疫荧光染色显示，Mb组在1 h开始吞咽 Mb，并且Mb直到 48 h 才被巨噬细胞完全代谢（图4g，h）。相比之下，在Mb + Ab组中，巨噬细胞RAW 264.7对肌红蛋白（Mb）的吞噬作用显著加快，并且在0.5小时时吞噬效果就已十分明显。这些结果表明，当Anti-Mb RabMAb 捕获Mb时，免疫复合物迅速被带到巨噬细胞，巨噬细胞对其特异性吞噬和降解。对于 Mb + Ab + DYN 组，免疫复合物存在到48小时，因为巨噬细胞吞噬功能被阻止。总之，抗 Mb RabMAb可以有效中和并防止游离Mb进入肾小管上皮细胞，同时促进巨噬细胞吞噬和降解 Mb。

图4. Anti - Mb RabMAb可阻止游离肌红蛋白进入肾小管上皮细胞，并促进巨噬细胞对肌红蛋白的吞噬作用。

3.最佳给药策略研究

在确认了Anti-Mb RabMAb治疗RM/CS-AKI的有效性及其作用机制后，作者进一步研究了Anti-Mb RabMAb的最佳给药策略，包括剂量、给药方式和时机。他们首先探讨了在静脉注射给药模式下，一系列Anti-Mb RabMAb浓度对肾功能的影响。可以看到与RM组相比，Anti-Mb RabMAb组肾功能显著改善（图5b - d），血液中肌红蛋白（Mb）和肌酸激酶（CK）含量更低（图5e），肾脏中肌红蛋白蓄积以及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和肾损伤分子1（KIM - 1）的表达水平更低（图5f）。并且在1mg/kg剂量时取得了最佳的治疗效果。接下来，为分析给药途径，作者通过静脉注射（i.v.）、腹腔注射（i.p.）、肌肉注射（i.m.）或皮下注射（s.c.）的方式给予1 mg/kg Anti - Mb RabMAb（图5g）。结果表明静脉注射的效果最佳。最佳给药时机显示RM/CS-AKI 后立即注射效果最好（图5m-r）。这些结果显示在RM/CS-AKI 后立即静脉注射1 mg/kg，可最大限度地改善肾功能，减少肾损伤。

图5. Anti-Mb RabMAb治疗RM - AKI小鼠的最佳给药剂量、给药方式和给药时机。

4.药代与安全性研究

最后作者对Anti-Mb RabMAb在RM/CS-AKI小鼠中的组织分布、药代动力学分析和毒性进行了评估。通过单次静脉注射Cy5标记的Anti-Mb RabMAb，观察了其在14天内的体内组织分布特征和代谢情况。体内成像显示，Anti-Mb RabMAb主要分布在血流量丰富且血管相对通透性较高的器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）以及存在肌红蛋白泄漏的受损肌肉中（图6a）。其在大脑和正常肌肉中的分布极少（图6a）。在急性肾损伤合并横纹肌溶解症（RM/CS - AKI）组小鼠中，注射Cy5标记的Anti-Mb RabMAb后约12 - 24小时，荧光信号达到峰值（图6a）。同时，RM/CS - AKI小鼠的肾脏和受损肌肉的荧光信号强度较高，而心脏内的信号较弱，在正常对照（NC）小鼠的正常肌肉组织中几乎检测不到荧光信号（图6b - e）。换句话说，抗Mb RabMAb不会在小鼠的心脏或正常肌肉组织中停留，而是选择性地靶向存在肌红蛋白泄漏的受损肌肉以及有显著肌红蛋白蓄积的肾脏，然后中和并促进肌红蛋白的降解。对各器官在不同时间点的荧光信号进行定量分析，结果与先前的描述一致。Anti-RabMAb在1天内达到峰值，并且在RM/CS - AKI小鼠的肾脏中停留时间比正常对照（NC）小鼠更长（图6c）。与此同时，在RM/CS - AKI小鼠受损肌肉中的含量显著增加，在大约5天时达到峰值，并在14天时完全代谢（图6d）。此外，抗Mb RabMAb在所有组小鼠心脏中的分布水平始终维持在较低水平（图6e）。同时Anti-Mb RabMAb的药代动力学分析结果支持其在体内组织的荧光分布情况（图6f、g）。从血浆浓度-时间曲线中，得到了最大血浆浓度（Cmax）和达到Cmax的时间（Tmax）（图6f、g）。NC组、RM - AKI组和CS - AKI组达到Cmax所需时间相近，分别为（2.50 ± 1.97）小时、（2.50 ± 1.97）小时和（2.67 ± 2.58）小时。抗Mb RabMAb的平均终末消除半衰期（T1/2）在NC组、RM - AKI组和CS - AKI组分别为（8.88 ± 0.29）天、（11.11 ± 0.60）天和（11.74 ± 0.54）天（图6g）。此外，从图5g中还得到了从时间0到无穷大的血清浓度 - 时间曲线下面积[AUC(inf)]、分布容积（Vz）和血浆清除率（CI）。这些结果表明Anti-Mb RabMAb在RM/CS-AKI模型小鼠中表现出明确的组织选择性、良好的靶向性、长效滞留能力和稳定的药代动力学行为，支持其作为RM/CS-AKI治疗候选抗体的临床潜力。

图6. Anti-Mb RabMAb在RM/CS - AKI小鼠体内的器官分布情况。

总结：

作者提出“移动屏障”创新治疗机制用于RM/CS-AKI治疗，通过利用抗原-抗体形成大分子量免疫复合物（>150 kDa）所产生的物理屏障作用，单次足量注射Anti-Mb RabMAb 可有效阻断游离肌红蛋白（Mb，约17 kDa）穿过肾小球滤过屏障（约69 kDa）。该方法显著减轻了同种（兔）及异种（小鼠）RM/CS-AKI动物模型中的肾脏损伤，并增强了巨噬细胞对Mb的吞噬与降解能力。本研究展示了生物抗体技术在应急创伤救治相关创新药物研发中的巨大应用潜力，并可能拓展至其他血液循环中游离肌红蛋白异常升高相关疾病的治疗领域。