NAR | 甲型流感病毒的DNA适体的独特i-motif结构

大家好，今天分享的文献是2025年1月发表在Nucleic Acids Research上的一篇文章，题目为：Unveiling the unusual i-motif-derived architecture of a DNA aptamer exhibiting high affinity for influenza A virus。作者是莫斯科国立大学副教授Elena G Zavyalova，她的主要研究内容有非经典DNA/RNA的结构与功能以及抗病毒分子工具的开发。

Graphical Abstract

背景介绍：

i-motif是富含胞嘧啶（C）的非B型DNA结构，通过半质子化的C:C⁺碱基对稳定（图1）。传统认为i-motif仅在酸性条件（pH 5-6）下稳定，但近年来的研究发现某些含有长C富集区域的序列在生理pH（~7.4）下也能稳定存在。目前，功能性i-motif多用于设计pH响应型适体，用于传感器或肿瘤治疗等。之前报道的针对甲型流感病毒的BV42适体（图1），含有长C富集区域，可能形成i-motif，而BV42的活性实验在中性条件下进行，因此i-motif结构对于该适体功能的必要性受到质疑。

本工作探究了BV42在生理pH下的功能机制，旨在阐明i-motif结构在血凝素结合中的作用。为了解决BV42固有的结构异质性，作者开发了一种新的方法来提高构象均一性，同时保留结合位点，从而产生对血凝素具有高亲和力和结构均一性的适体。利用核磁共振波谱（NMR）成功解析了BV42的结构，揭示了i-motif和双链体之间的柔性连接，突出了对蛋白质识别至关重要的独特适体架构。

图1. i-motif结构和DNA适体BV42的序列

结果与讨论：

1 pH 对 BV42 亲和力的影响

为了确定i-motif结构在蛋白质识别中的作用，作者在不同pH下评估了BV42对血凝素的亲和力。分别在pH 6.0（折叠i-motif）或8.0（未折叠i-motif）条件下，通过生物层干涉测量法测量适体与固定化重组血凝素的结合。在pH 6.0时K_D为1.4 ± 0.4 nM，而在pH 8.0时，K_D增加至176 ± 9 nM（图2）。适体与甲型流感病毒（每个病毒颗粒携带约1000个血凝素分子）的结合亲和力也表现出pH依赖性。在pH 6.0时，BV42：H7N1亚型甲型流感病毒复合物KD为0.010 ± 0.002 pM（图2）。在pH 6.0时，未观察到对新城疫病毒以及在pH 8.0时H7N1亚型甲型流感病毒的亲和力（图2）。总之，BV42表现出pH依赖性的结合亲和力。

图2.不同pH下评估BV42对血凝素的亲和力

2 i-motif 形成的必要性

虽然典型的i-motif仅在酸性条件（pH 5-6）下稳定，但是圆二色光谱（CD）实验证明了BV 42即使在中性pH下也能形成稳定的i-motif。BV42在pH 6.0-7.0的CD光谱中显示i-motif特征峰（285 nm正峰，263 nm负峰）（图3）。在pH 8.0下，CD谱图类似于非结构化寡核苷酸（图3）。观察到的pHi为7.3，与含有长C富集区域的i-motif一致，如来自HIF-1α启动子区域的i-motif（pKa = 7.2）。

接着，使用¹H NMR进一步研究BV42结构（图3），谱图显示Watson-Crick（12.0-13.5 ppm）和半质子化C：C⁺（15.0-16.0 ppm）碱基对的特征亚氨基信号。两组亚氨基信号随温度升高同时降低，表明i-motif和双链体部分在相似温度下同时解折叠。

图3. BV42与血凝素的光谱数据

虽然半质子化的C：C⁺碱基对被认为是i-motif的特征标记，但它们也可以出现在富含C的双链体中。而Ag⁺以前被认为是质子的替代物，用于稳定i-motif，但最近的研究表明Ag⁺稳定平行的双链体胞嘧啶束，而不是i-motif结构。在pH 7-8的BV42中，加入AgNO₃，CD光谱证实了折叠i-motif（pH 7.0和7.3）和未折叠i-motif（pH 8.0）的构象均变为胞嘧啶平行双链体（图4），其特征在于在等摩尔浓度的Ag⁺下，在267 nm有强负峰，在290 nm有弱正峰，该结构对血凝素的亲和力明显降低（图4），证明了i-motif结构对于适体生物活性的必要性。

图4.不同pH下加入Ag⁺的CD光谱

3 BV42 的构象异质性

分子动力学（MD）模拟预测BV42存在6种构象异构体，差异在于第二环含不同数量胞嘧啶（图5）。六种构象异构体显示出相似的自由能，表明BV42表示为一组共享双链体模块的i-motif混合体。所有预测的变体包含10个C：C⁺对和一个保守的AAGAAGAA环。还揭示了双链体中与i-motif相邻的A-T碱基对的破坏，这表明i-motif的形成扰乱了相邻的双链体结构。然后进一步分析检查了i-motif和双链的同轴度，在模拟过程中，它们各自的轴之间的角度迅速下降到139°，并在±15°范围内波动（图5），表明两个模块之间的灵活连接。

图5. BV42的MD模拟结果

4 tC⁰修饰对 i-motif 结构的推定

由于i-motif部分存在多种构象，为了测定BV42的结构，作者采用tC⁰进行修饰。已知具有三环的胞嘧啶类似物tC⁰，能够与胞嘧啶残基形成半质子化碱基对。它还是一种荧光核碱基，能够监测i-motif内的局部环境。由于与周围质子化C的电子耦合相互作用，表现为tC⁰荧光猝灭。将修饰插入到BV42适体中以阐明i-motif的优选构象和C：C⁺对的局部稳定性。分别修饰第一个C5段（C11-C15）、第二个C5段的末端胞嘧啶（C24和C28）和推定的第二个C环区域中的核苷酸（C29、C30、C31和C32）以鉴定参与i-motif形成的胞嘧啶。荧光猝灭实验证实了i-motif折叠及其结构多态性（图6）。

tC⁰修饰的适体与血凝素的亲和力研究可以深入了解参与靶点识别的结构部分。在BV42⁰C28和BV42⁰C31中亲和力影响最大。BV42⁰C28亲和力最差，BV42⁰C31亲和力最好。C28和C31修饰的适体亲和力的偏差表明这些残基参与了与血凝素的结合。而两个修饰的位置都位于第二环附近或第二环内。为了检验第二环是否为血凝素识别位点，设置了对照寡核苷酸，具有双链体模块、i-motif模块，但第一、第二和第三环被T3取代。该变体与血凝素的结合弱得几乎消失，说明了环在蛋白识别中的重要性。总的来说，分子探测证实了推定的i-motif结构，并定位了第二环附近的血凝素识别位点。

图6. tC⁰修饰的分子探测结果

5 结构研究：基于i-motif的适体的重新设计

近年来，人们在中性pH条件下发现了i-motif与B-DNA共存的DNA分子。该结构在中性pH下保持稳定，部分原因是存在覆盖i-motif的一个边缘的小沟G：T：G：T四分体。小沟四分体可以诱导邻近C：C+碱基对的pKa显著变化，导致在中性pH下的强稳定性。在i-motif部分的一侧存在小沟四分体不仅稳定了结构，还消除了C滑动的潜在影响，从而可以获得更高质量的NMR谱图。因此作者使用这种方法来重新设计BV42适体，以获得更全面的结构信息。其中 CapTr5C1、CapTr5C3 与亲本适体 BV42 对血凝素亲和力相似，CapTr4C3 的结构通过 NMR 得到部分解析。首先作者用CD和核磁验证了该设计可以提高i-motif结构的稳定性。CapTr4C3的CD谱图和核磁共振谱如图7所示。互补区采用典型的B型螺旋结构。6个C：C+碱基对明显插入，形成标准的i-motif。胞嘧啶C9、C20、C24和C35以及第二环中的3个胞嘧啶没有形成碱基配对，表明i-motif 与双链通过柔性连接，独特的i-motif/双链连接结构与之前的文献报道7O5E（中性条件下的i-motif结构，高度同轴，连续碱基堆叠）形成对比（图7）。