NAT COMMUN丨一种量化蛋白质、DNA和纳米粒子在细胞中定位的分子传感器

作者：徐雪梅

介绍一篇最近发表在Nature Communications上的文章，一种量化蛋白质、DNA和纳米粒子在细胞中定位的分子传感器。通讯作者是来自于澳大利亚莫纳什大学的Angus P. R. Johnston未来研究员，其课题组研究方向主要为免疫、纳米生物技术、胶体、递送体系等。

物质的摄取和细胞内的转运对于正常的细胞功能、疾病发病机制和药物传递都非常重要，且细胞内转运控制着受体信号传导、免疫反应和纳米药物的命运。当前，细胞内转运过程通常是通过共焦显微镜观察荧光标记的共定位来跟踪的。但是此定位技术受到低吞吐量和显微镜分辨率的限制，容易受到主观解释的影响，并且可能错过转运过程中瞬间的相互作用。为了解决这个问题，本文开发了一种定位传感器，它由一个淬灭的SNAP-tag底物（SNAPswitch）组成，它可以通过点击化学与生物分子结合。在苄基鸟嘌呤分子上分别修饰一个猝灭基团（QSY-21）和PEG-叠氮赖氨酸，再在赖氨酸上修饰一个荧光分子Cy5。叠氮基团可以通过点击化学与想要探究的物质（蛋白质或DNA等）连接。此时，整个SNAP底物是被猝灭的，当整个SNAPswitch与SNAP-tag的蛋白相遇时，通过几步反应，苄基鸟嘌呤脱去猝灭分子并将其转移到SNAP-tag蛋白上，苄基鸟嘌呤带着荧光分子及待研究的物质离开猝灭分子并释放出荧光（图1a、1b）。细胞稳定表达SNAP-tag的蛋白可以定位到细胞的不同区域，以探测到物质到不同亚细胞腔室的转运情况。SNAP-tag融合到转铁蛋白受体上，用于早期内涵体定位，SNAP-tag融合的跨膜蛋白106b用于探测物质在晚期内涵体/溶酶体定位，SNAP-tag融合的胞浆蛋白用于探测内吞后物质逃逸，SNAP-tag融合的组蛋白可用于探测细胞核内转运核酸。

以商业SNAP-Cell SiR 647底物与SNAP-tag蛋白结合为对照，体外实验证明，SNAPswitch分子传感器可与SNAP-tag蛋白相互作用并释放出Cy5的荧光（反应之前是猝灭的）（图2a，2b）。随着SNAP-tag蛋白与分子传感器比例的增加，荧光也逐渐升高，一定比例下的反应体系，Cy5荧光随时间的增加而增强（图2c）。

 

图1 a 可定位亚细胞器的转运传感器原理图；b SNAPswitch分子示意图；c 以表达SNAP-tag的转铁蛋白受体/Cyto-SNAP蛋白/TMEM106b-SNAP蛋白/组蛋白-SNAP为例解释传感器的工作原理。

 

图2. a SNAPswitch与SNAP-tag蛋白孵育后的荧光胶图；b 有和无SNAP-tag蛋白荧光对比；c 不同SNAP-tag蛋白当量下Cy5荧光随时间变化图。

 

体内SNAPswitch传感器的激活：

SNAPswitch传感器预先与各种带BDP-FL荧光的抗体偶联，再与野生型或稳定表达hTfR-SNAP的3T3（小鼠来源）细胞孵育。野生型3T3细胞膜上表达CD44和mTfR（鼠转铁蛋白受体），而没有hTfR（人转铁蛋白受体）。CD44蛋白用来验证SNAPswitch传感器不会在细胞膜上非特异性地激活。故，野生型细胞上有CD44和mTfR的抗体荧光，而没有hTfR抗体的荧光。稳定表达hTfR的3T3细胞上均有三种抗体的荧光，这些荧光均来自于抗体上修饰的BDP荧光（图3a）。由于野生型3T3细胞没有SNAP-tag，所以三种抗体均没有Cy5荧光，而稳定表达hTfR-SNAP-tag的细胞上有mTfR和hTfR的荧光，说明SNAPswitch遇到SNAP-tag蛋白反应释放出Cy5的荧光，同时说明hTfR在细胞膜上的位置与mTfR相邻（图3b）。随着反应时间的增加，至5h时，野生型3T3细胞上Cy5的荧光一直保持为0，而稳定表达hTfR-SNAP-tag的3T3细胞中三种抗体的Cy5/BDP-FL的比例，除了CD44，另外两个抗体的荧光比例均有增加，与1h相比增加的并不多，说明此反应发生较快（图3c，3d）。通过计算由SNAPswitch生成的Cy5信号与由BDP-FL信号确定的抗体存在量的比率来解释抗体结合量的微小变化。SNAPswitch偶联的mTrR抗体和SNAPswitch偶联的hTrR抗体与细胞表面的SNAP-tag蛋白结合反应后，被转运进细胞，与细胞渗透性荧光SNAP（SNAP-Cell 505-Star）标记的hTfR-SNAP共定位（图3e，3f）。

 

图3. a，b SNAPswitch传感器特异性表征；c，d SNAPswitch传感器稳定性表征；e，f  SNAPswitch传感器与hTfR-SNAP-tag结合后转运至细胞内吞小体的共定位成像。

 

SNAPswitch反应的量化：

通过将细胞内观察到的Cy5激活信号与体外SNAPswitch激活后的最大信号比值，可以量化与活细胞中hTfR-SNAP相互作用的抗体总量。同样地，将AF488标记的抗体与SNAPswitch偶联后，在溶液中，30 M过量的SNAP-tag在一小时内可最大激活SNAPswitch传感器的Cy5荧光（图4a），图4b证明，野生型3T3细胞与mTfR抗体结合不受影响，具有抗体自带的AF488荧光，而表达TfR-SNAP的3T3细胞上有SNAP-tag，故而可与SNAPswitch反应并释放出Cy5荧光，在野生型3T3细胞和hTfR-SNAP-tag细胞中，经SNAP-tag处理的抗mTfR的SNAPswitch-AF488比值是相同的（图4c）。为了量化定位，计算SNAPswitch被SNAP-tag激活的荧光与预先全部激活的荧光做比值。观察到87%的hTfR抗体荧光激活及32%的mTfR荧光激活，说明只有部分的mTfR靠近hTfR-SNAP-tag蛋白。

 

图4. a SNAP-tag与SNAPswitch的当量比与Cy5荧光的关系；b，c Cy5与AF488比值量化细胞内SNAPswitch反应；d SNAPswitch携带的抗体的定位量化。

为了证明SNAPswitch能够分辨物质被递送至内涵体膜的哪一侧，作者将SNAP-tag融合到驻留的晚期内涵体/溶酶体跨膜蛋白（TMEM106b）的N端或C端。TMEM106b蛋白的N端在细胞质中，C端在溶酶体腔内。设计细胞稳定表达SNAP-TMEM106b（SNAP-tag在N端，细胞质中）或者TEME106b-SNAP（SNAP-tag在C端，溶酶体腔内），用商业的SNAP-Surface 647（已知此底物不会在细胞质中存在）为底物去感应SNAP-tag，5a表示溶酶体腔内发生了SNAP反应，而b图SNAP-tag在N端即细胞质中，没有发生SNAP反应。用SNAPswitch偶联的mTfR-488抗体与细胞孵育，发现不论SNAP-tag在N端细胞质中还是C端溶酶体腔内，均不会影响抗体与TfR的结合，但是SNAPswitch的信号只有当SNAP-tag在溶酶体腔内的时候会被点亮，说明mTfR抗体偶联的SNAP-switch复合物在溶酶体中（图5c，5d）。

 

图5. a SNAP-tag在C端溶酶体腔中可以与底物SNAP-Surface 647反应；b SNAP-tag在N端细胞质中不与底物反应；c，d SNAPswitch传感器在溶酶体内外的定位验证。

 

将核酸输送到胞浆和细胞核是基因治疗应用的关键，但这种转运的效率很难确定。Lipofectamine3000是一种阳离子脂质制剂，能将DNA浓缩成纳米复合物，被广泛用作诱导内涵体逃逸的转染试剂。作者利用细胞核内稳定表达H2A-mTurq-SNAP-tag的细胞来探究SNAPswitch递送寡核苷酸的能力。图6a表示mTurquoise阳性细胞具有SNAP结合功能，说明HEK293稳定表达mTurq-SNAP-tag。AF488修饰的核苷酸链偶联SNAPswitch传感器的AF488荧光在野生型HEK293细胞和mTurq-SNAP-tag阳性细胞中无明显差别，且0-2h内，SNAP-switch信号没有比野生型细胞内荧光高很多，说明0-2h内，核苷酸尚未被递送至细胞核内，2-4h中，SNAP信号明显增强，说明此期间，核苷酸被递送至细胞核内（图6b，6c）。 利用共聚焦观测SNAPswitch传感器在Cyto-SNAP细胞或者H2A-SNAP细胞中的定位。在Cyto-SNAP细胞中，SNAPswitch信号呈分散的亮点式，由于Cyto-SNAP不在溶酶体中，猜测此时DNA仍然在Lipo3000中并分散在细胞质中（图6d）。H2A-SNAP细胞中，细胞核呈现SNAPswitch的信号（图6e），而没有SNAP表达的细胞中，没有SNAPswitch的信号（图6f）。最后，通过流式分析，HEK细胞稳定表达TfR-SNAP、Cyto-SNAP或H2A-SNAP并转染含AF488和SNAPSwitch寡核苷酸的脂质体3000复合物，随时间的信号变化，表示核苷酸复合物从内涵体向细胞质再向细胞核转运的过程。

 

图6. a HEK293细胞稳表H2A-mTurq-SNAP-tag的验证；b Lipo3000复合物与转染H2A-SNAP或空质粒的细胞的关联验证；c 以阴性细胞减除后的信号为背景，对mTurquoise表达阳性的细胞中的SNAPSwitch信号进行检测；d，e，f  HEK293中SNAPswitch传感器携带的核酸复合物的成像；g 稳定表达不同位置蛋白的细胞中SNAPswitch信号与AF488信号比值随时间的变化。

 

总结：利用SNAPSwitch，证明了其定量运输细胞表面受体的能力，如TfR和CD44。当被标记的材料在特定亚细胞位置遇到SNAP标记的蛋白质时，SNAPSwitch会永久开启。与基于图像的共定位分析相比，这是一个改进，图像共定位分析很难检测到过渡过程，例如发生在内质体贩运和逃逸的过程。流式细胞仪的使用意味着可以对>10000个细胞进行稳健的统计分析，而不是对<100个细胞进行基于图像的共定位。SNAPswitch还能够以非常高的分辨率确定细胞器内外的定位。研究者还追踪了与脂质体3000复合物的DNA被摄取到内质体中，随后转移到胞浆中，随后转移到活细胞中的核组分。在这一过程中，每个位置的物质存在量都在减少，这一结果支持了目前的观点，即内体逃逸是核酸传递的一个主要瓶颈。

Laura I. FitzGerald, Luigi Aurelio, Moore Chen, Daniel Yuen, Joshua J. Rennick, Bim Graham, Angus P. R. Johnston, Nature Communications, 2020, 8, 11(1): 4482.