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核酸分子工程与纳米技术实验室

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NAT BIOTECH丨利用CRISPRa诱导的报告基团从条形码化细胞群中分离活细胞克隆

作者:高倩倩

同一基因组 编码产生数百种具有 不同功能细胞类型,这是复杂生物形成的基础。最近的单细胞研究表明,即便是在单克隆细胞群中,也存在显著的细胞异质性。亚克隆种群的形成和进化选择塑造了从生物发育,组织分化和细胞重编程到疾病发展和耐药性产生等重要生物学过程。传统的谱系追踪方法可用于绘制进化选择前后细胞群体的异质性,但如何对单个祖细胞 进化选择过程中的每个时期进行功能化表征仍然是一项研究空白。

奥地利维也纳生物中心(VBC)分子病理研究所(IMP)的Anna Obenauf 教授近期在Nature Biotechnology期刊上发表了题为“Isolating live cell clones from barcoded populations using CRISPRa-inducible reporters”的研究论文。本文开发了一种CaTCH(CRISPRa tracing of clones in heterogeneous cell populations)技术,该技术采用精确的克隆追踪技术,可以追踪数百万个细胞,并能够在任何时间点从复杂的细胞群体中分离出存活的特定克隆。这项技术首先将融合了转录激活因子的dCas9(dCas9-VPR构建体)转导入细胞,然后用融合了可诱导绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的DNA条码唯一性标记细胞。经过实验选择(进化选择)后,通过下一代测序(NGS)鉴定富集和耗竭克隆株的条形码,随后设计靶向条形码的sgRNA。sgRNA转导到异质性细胞群中,并能在目标克隆中特异性地将dCas9-VPR引导至条形码(barcode)处激活GFP表达。随后通过细胞分选(FACS)分离感兴趣的克隆并进行功能表征。 通过在实验选择之前或期间保存细胞,可以在选择过程的任何阶段识别出所选择克隆的祖细胞克隆。Anna Obenauf 带领团队证明了这项技术可以捕获仅占0.001%的稀有克隆,并对体内黑色素瘤靶向治疗的耐药性的产生进行了研究。

1 | CaTCH:条形码引导的CRISPRa诱导报告基团用于分离特定细胞克隆 aCaTCH工作流程。用dCas9VPR构建体和条形码(BC)报告基因转导异源细胞群后,将部分细胞用于选择实验,以鉴定具有所需表型的克隆。该克隆的特定条形码序列由NGS识别,并用于设计互补的sgRNA构建体。 sgRNA被转导到保留的未选择群体中,并特异性地将dCas9-VPR引导至目标条形码以激活GFP表达。 GFP阳性克隆可以通过FACS进行活体分离并用于功能研究b,单个条形码标记的A375细胞中CaTCH报告基团激活的示意图和FACS图。仅当存在与条形码互补的sgRNA时,才会诱导GFP表达c.用于确定混合实验中CaTCH报告基团激活敏感性的实验设计。dc中所示的混合实验的FACS图。上排显示GFP信号,下排另外显示混入的iRFP 阳性细胞群体。ed的定量,包括额外混入细胞的比率(相应的FACS图在图3a的扩展数据中显示)f,追踪和CaTCH分离已存在的,具有治疗抗性的细胞克隆的实验流程:将具有已知条形码的表达NrasG12D-iRFP的克隆掺入复杂的条形码背景细胞群中,并用安慰剂或RAFi处理。g,通过FACS测量RAFi处理超过31 天后iRFP阳性细胞的富集。hFACS图显示了掺入细胞的CaTCH报告基团激活。 GFP +细胞被分选,扩增并对其条形码进行测序。 条形图显示了在31 d安慰剂或RAFi处理之后或在CaTCH分离后),与目标条形码相对应的已识别条形码的百分比。

 

2 | CaTCH分离的未经处理的克隆最初会对RAFi / MEKi处理产生反应,并在体内获得耐药性 a,实验概述:(1)将条形码标记的细胞群皮下接种到C57BL / 6小鼠中(2RAFi / MEKi处理并产生抗药性之后(3),切除肿瘤,对条形码标记细胞进行测序,然后进行培养(4)从肿瘤来源的抗性(R)细胞和未经治疗的(TN)起始细胞群中分离得到感兴趣的克隆bRAFi / MEKi治疗或安慰剂治疗的黑色素瘤肿瘤的个体肿瘤生长曲线 (未经治疗,从四只小鼠中分离出四个肿瘤; RAFi / MEKi,从五只小鼠中分离出五个肿瘤。)c,通过NGS识别的独特条形码的总数(REF,起始细胞系; T1-T9,单个肿瘤;每只小鼠一个肿瘤)d,由NGS识别的条形码组成。超过1%的样本的条形码以彩色突出显示,总计包括少于1%的条形码的条形码(白色条)。e,从TN起始群体隔离CaTCH之前(底部,灰色)和之后(顶部,蓝色)的条形码比例。条形码按其在开始细胞群中从高(左)到低(右)的分布进行排序。隔离的条形码以点突出显示,CaTCH隔离后它们的倍数变化富集以蓝色表示。条形码以其在开始种群中的丰富程度(1,数量最多)命名。 f,实验概述和从单个CaTCH分离的克隆建立的肿瘤的体内RAFi / MEKi治疗反应。数据显示为平均值±s.e.m

总之,本文作者建立了CaTCH,用于区分和分析异质群体中的特定细胞克隆。CaTCH不仅允许在选择的起点和终点之间进行特定细胞差异性比较,而且还可以在选择的任意中间阶段对特定细胞进行差异性比较。尽管最近出现了有关克隆隔离的相关方法,但是它们的技术执行方式却大不相同,CaTCH在单元跟踪和隔离功能方面具有最高的效率和分辨率。他们使用CaTCH研究了体内靶向治疗过程中的亚克隆进化,发现RAFi / MEKi耐药性很大程度上不是由先前存在的抗性克隆的选择引起的,大多数克隆的耐药性均由后期的基因突变获得。通过干扰此类进化过程的策略,可能延迟耐药性的出现并改善治疗的持久性。CaTCH的未来应用范围从基础生物学到再生医学。例如,阐明转移,重新编程和分化过程中的克隆选择和适应过程。

Christian Umkehrer, Felix Holstein , Laura Formenti ,  et al. Isolating live cell clones from barcoded populations using CRISPRa-inducible reporters.Nat Biotechnol. 2020 Jul 27. doi: 10.1038/s41587-020-0614-0.

 

2020年8月18日 16:53
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