NAT NANOTECH | 利用DNA折纸精确排列抗原以激活B细胞

作者：杨林林

介绍一篇最近发表在Nature Nanotechnology上的文章，本文通讯作者为麻省理工大学的Darrell Irvine和Mark Bathe教授。Darrell Irvine课题组研究方向分别为应用工程工具解决细胞免疫学问题，开发用于疫苗和药物传递的新材料。目前的研究重点是艾滋病毒疫苗研制和癌症免疫治疗。Mark Bathe课题组研究方向是核酸纳米技术、合成结构生物学、治疗性核酸传递等。

天然病毒是抗原排列在颗粒表面的纳米颗粒，人们认为免疫系统(特别是B细胞)已经进化到能够有效识别这种颗粒抗原。目前正在开发的纳米疫苗以模仿自然病毒结构，通过在纳米颗粒表面排列多个抗原来增强B细胞活化，进而提高疫苗效力。然而，确定正确的颗粒大小和刚性、抗原之间的间距和每个颗粒抗原的数量以最佳地刺激B细胞(通过其B细胞受体与目标抗原结合)一直是一个挑战。本文作者以DNA折纸为支架，在其表面以精确的方式排列临床疫苗免疫原eOD-GT8（HIV-1包膜糖蛋白抗原gp120的GT工程外域）来模拟病毒和疫苗的颗粒结构，以系统地研究这些纳米级参数对体外B细胞活化的影响。

 

图1 DNA折纸纳米颗粒（DNA-NP）精确可控地排列HIV抗原示意图。

抗原特异性B细胞的有效激活是新疫苗设计的主要目标。此前，Schief等通过将60个HIV抗原eOD-GT8与细菌蛋白二氧四氢喋啶合酶融合进行多聚化，制备了直径约30 nm的蛋白纳米颗粒（eOD-60mer），体外和体内实验均证实此HIV疫苗蛋白可激活B细胞。本文作者将eOD-GT8附着在DNA折纸上（DNA-NP），系统地考察了抗原拷贝数与间距在激活B细胞中的作用。设计了两种DNA折纸结构：与典型病毒大小和形状相似的三维二十面体颗粒（40 nm）和一维刚性六螺旋束（80 nm）（图1）。

作者首先使用直径约40 nm的二十面体DNA–NP，分析了eOD-GT8价态对激活B细胞的作用（图2c, d），通过动态测量细胞内钙信号来监测IgM-BCR的激活。将稳定表达VRC01 IgM受体的Ramos B细胞与相当于0.5 nM或5 nM总eOD-GT8的DNA–NP孵育，使用荧光细胞内钙指示剂光谱法记录B细胞的响应。和预期一致，游离抗原-DNA纳米粒子或单个拷贝在任一抗原浓度都不能激活B细胞。相反，携带两个或多个eOD-GT8拷贝的NP会随着抗原数目的提高而使细胞响应增加。

 

图2增加DNA-NP的抗原价态以提高B细胞响应。

接下来，作者考察抗原间距对IgM-BCR触发的影响。为了在不存在可能混淆的三维几何变化的情况下评估抗原间距，作者使用简单的6HB制成的一维刚性DNA折纸棒。在固定的总抗原浓度下，细胞响应随抗原间距的增加而增加（图3a），在25–30 nm的抗原间隔处达到平台期。流式细胞术分析显示7 nm和28 nm抗原间距的DNA-NP与B细胞的结合基本相同（图3b），可证实抗原间距对IgM-BCR触发的影响不是由于IgM-BCR与纳米结构的不同结合力所致。图3c考察了DNA-NP支架刚性对抗原触发IgM-BCR的作用，与刚性DNA-NP相比，附着eOD-GT8的柔性聚合物引起的B细胞信号传导大大减少，以上结果证实了抗原间距和刚性结构支架的重要性。

 

图3 IgM-BCR的响应随刚性支架上抗原间距的增加而增加然后达到平台。

为了进一步研究抗原间距对B细胞响应的影响，作者在二十面体DNA–NP的一个面上排列了五个eOD-GT8抗原，结果显示抗原间距的增加仍然导致细胞响应的增加（图4）。

图4抗原在二十面体DNA-NP上的间距变化对B细胞响应的影响。

为了探究DNA-NP激活B细胞的机制，作者使用荧光成像技术检查了三种不同的DNA-NP：两个6HB-2×，其抗原间隔分别为7和28 nm，分别触发低和高的B细胞活化；以及一个DNA二十面体NP附着了30个eOD-GT8，这些抗原触发强劲的B细胞活化。荧光标记eOD-GT8的DNA纳米颗粒加入到Ramos细胞，和预期一致，DNA-NP与细胞的结合与细胞表面VRC01 IgM的表达密切相关，而缺乏IgM的细胞则无法结合带有eOD-GT8的颗粒（图5b）。仅添加DNA-NP或eOD-GT8-60mer 1分钟后，磷酸化Syk激酶（pSyk）的抗体染色即可显示磷酸化pSyk的急剧增加。此外，与较大间距的DNA-NP（6HB-2×-28 nm）相比，短间距的DNA-NP（6HB-2×-7 nm）导致pSyk积累明显较低（图5c）。使用鬼笔环肽对细胞皮质中的肌动蛋白进行染色来表征eOD的内在化，与6HB-2×-7 nm和6HB-2×-28 nm相比，lco-30×的内在化程度更高（图5d）。这些结果证实了这三种DNA-NP的细胞激活水平，并证实了先前观察到的钙响应是通过IgM-BCR介导的活化途径起作用，包括pSyk磷酸化和下游NP内在化。

 

图5 共聚焦显微镜观察Ramos B细胞上的DNA-NPs。

与先前的研究和B细胞触发的模型一致，免疫原间距和其化合价为IgM-BCR活化和细胞应答的两个关键决定因素。此外，实验结果也清楚地指出了支架刚度对于维持抗原间分离以实现最佳IgM-BCR激活的重要性。最后作者应用粗粒度反应扩散模型探索DNA-NPs触发B细胞后的BCR信号传导，解释了为什么抗原之间距离越远，结果越好。当抗原与B细胞表面的受体结合时，被激活的受体在细胞内相互交联，增强应答。如果抗原靠得太近，空间位阻会限制招募到每个抗原的IgM-BCRs总量，从而使细胞应答减弱。

总而言之，本文作者以DNA折纸为支架来控制eOD-GT8抗原的空间表达，确定了最佳激活B细胞几种设计标准，包括五以上的化合价，相邻间距大于25–30 nm，使用刚性支架排列抗原，这些结果为合理设计基于蛋白质的疫苗平台和其他疫苗平台提供了重要基础。

Rémi Veneziano, Tyson J. Moyer, Matthew B. Stone, Eike-Christian Wamhoff, Benjamin J. Read, Sayak Mukherjee, Tyson R. Shepherd, Jayajit Das, William R. Schief, Darrell J. Irvine & Mark Bathe. Role of nanoscale antigen organization on B-cell activation probed using DNA origami. Nat. Nanotechnol. (2020). https://doi.org/10.1038/s41565-020-0719-0