NAT BIOTECH丨基于CRISPR-Cas12的SARS-CoV-2检测

作者：郑婷婷

2019年12月，中国武汉开始爆发β-冠状病毒重症急性呼吸综合征SARS-CoV-2。与SARS-CoV-2感染相关的疾病COVID-19迅速传播，导致全球大流行。虽然一些实验室已经开发出使用qRT-PCR方法能够在4-6小时内检测病毒，但由于需要将样本隔夜运送到检测实验室，用于筛查和诊断可疑SARS-CoV-2患者的周转时间超过24小时。另外，尽管血清学测试快速且需要很少的设备，但患者在症状发作后可能需要几天到几周才能检测到抗体反应，该法不适用于急性SARS-CoV-2感染的诊断。Mammoth Biosciences公司的Janice S. Chen和加州大学旧金山分校的邱华彦开发了一种基于CRISPR-Cas12的快速（<40分钟），易于实施且精确的侧向流分析技术，用于从COVID-19患者呼吸道拭子提取的RNA中鉴定出SARS-CoV-2，该方法称为“SARS-CoV-2的DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统（DETECTR）”，为qRT-PCR测定法提供了直观、快速的替代方法，阳性预测率达95％，阴性预测率达100％。

研究人员首先针对SARS-CoV-2的E（包膜）基因和N（核蛋白）基因设计了环介导等温扩增（LAMP）引物（图1a）。接下来，研究人员证明了基于CRISPR–Cas12的检测方法可以区分SARS-CoV-2和其他相关的冠状病毒菌株（bat-SL-CoVZC45和SARS-CoV），且对于N基因gRNA没有交叉反应性，而对E基因gRNA有预期的交叉反应性（图1b）。

经过优化，确定以E基因，N基因和人RNase P基因为对照的SARS-CoV-2 DETECTR分析条件，常规的RNA提取可用作DETECTR（E基因，N基因和RNase P的LAMP预扩增和基于Cas12的检测）的输入，DETECTR分析可以在大约30–40分钟内运行，并在侧流条上可视化（图1c，d）。如果同时检测到E和N基因，则认为SARS-CoV-2 的DETECTR检测为阳性；如果检测到E或N基因，则认为为假阳性（图1e）。

 

图1：一种基于CRISPR–Cas12的检测SARS-CoV-2的方法。

DETECTR检测反应的可视化是使用FAM-生物素报告分子和旨在捕获标记核酸的侧流条实现（图2a）。未切割的报告分子在第一条检测线（C线）处捕获，而被切割的报告分子在第二条检测线（T线）处产生信号。为了比较Cas12切割在使用荧光或侧向流动时产生的信号，研究人员使用5 fM和0 fM的 N基因体外转录模板（IVT）作为检测目标，在不到1分钟的时间内即可检测到荧光信号，并在5分钟内通过横向流动获得了视觉信号（图2b，c）。接下来，作者比较了RT-LAMP / Cas12 DETECTR荧光检测相对于美国FDA EUA批准的CDC检测的SARS-CoV-2检测的分析极限（LoD）（图2d）。与CDC qRT-PCR测定法相比，DETECTR横向流动测定法可轻松定性是否存在病毒。加利福尼亚公共卫生部测试的CDC分析的估计LoD为每微升1个拷贝，而DETECTR分析为每微升10个拷贝。

接下来，作者测试了从6例PCR阳性的COVID-19患者（COVID19-1A / B至COVID19-5A / B）收集的11种呼吸拭子样本中提取的RNA，其中A指鼻咽拭子，B指口咽拭子， COVID19- 6指的是鼻咽拭子。使用SARS-CoV-2 DETECTR分析法从流感患者（n  = 5）和常见的人类季节性冠状病毒感染患者（n = 7，OC43，HKU1、229E和NL63）提取的12份鼻咽拭子样本进行检测并读取侧向流动条荧光强度（图2e，f）。在11例患者拭子中有9例检测到SARS-CoV-2，并且未与其他呼吸道病毒交叉反应。

 

图2：在人工和临床的鼻咽或口咽拭子样本中检测SARS-CoV-2

 

表1：用于检测SARS-CoV-2的DETECTR（RT-LAMP / Cas12）分析与CDC qRT-PCR分析的比较

综上所述，该法将等温扩增与CRISPR–Cas12 DETECTR技术相结合，开发了一种快速（30–40分钟）测试方法以检测临床样品中的SARS-CoV-2，准确性与qRT-PCR相当，并使用简单的方法和可商购的“现成”试剂，为qRT-PCR测定法提供了直观，快速的替代方法。但由于DETECTR分析使用与其他qRT-PCR分析有类似的样品收集和RNA提取过程，因此在个人防护设备，提取试剂盒和试剂的可用性方面存在相同的潜在限制。与qRT-PCR相比，DETECTR的一些关键优势包括：等温信号放大消除了对热循环的需要，快速的周转时间，单核苷酸靶标特异性，简单可视化的读取方式（例如侧向流动条），并且不需要复杂的实验室基础设施。开发和验证SARS-CoV-2 DETECTR分析所花费的时间表明，该技术可以快速用于诊断新出现的人畜共患病毒的感染。

Broughton JP, Deng X, Yu G, et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020;38(7):870-874. doi:10.1038/s41587-020-0513-4