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核酸分子工程与纳米技术实验室

NAT BIOTECH丨基于CRISPR-Cas12的SARS-CoV-2检测

作者:郑婷婷

201912月,中国武汉开始爆发β-冠状病毒重症急性呼吸综合征SARS-CoV-2。与SARS-CoV-2感染相关的疾病COVID-19迅速传播,导致全球大流行。虽然一些实验室已经开发出使用qRT-PCR方法能够在4-6小时内检测病毒,但由于需要将样本隔夜运送到检测实验室,用于筛查和诊断可疑SARS-CoV-2患者的周转时间超过24小时。另外,尽管血清学测试快速且需要很少的设备,但患者在症状发作后可能需要几天到几周才能检测到抗体反应,该法不适用于急性SARS-CoV-2感染的诊断。Mammoth Biosciences公司的Janice S. Chen和加州大学旧金山分校的邱华彦开发了一种基于CRISPR-Cas12的快速(<40分钟),易于实施且精确的侧向流分析技术,用于从COVID-19患者呼吸道拭子提取的RNA中鉴定出SARS-CoV-2,该方法称为“SARS-CoV-2DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统(DETECTR)”,为qRT-PCR测定法提供了直观、快速的替代方法,阳性预测率达95%,阴性预测率达100%。

研究人员首先针对SARS-CoV-2E(包膜)基因和N(核蛋白)基因设计了环介导等温扩增(LAMP)引物(图1a)。接下来,研究人员证明了基于CRISPR–Cas12的检测方法可以区分SARS-CoV-2和其他相关的冠状病毒菌株(bat-SL-CoVZC45SARS-CoV),且对于N基因gRNA没有交叉反应性,而对E基因gRNA有预期的交叉反应性(图1b)。

经过优化,确定以E基因,N基因和人RNase P基因为对照的SARS-CoV-2 DETECTR分析条件,常规的RNA提取可用作DETECTRE基因,N基因和RNase PLAMP预扩增和基于Cas12的检测)的输入,DETECTR分析可以在大约30–40分钟内运行,并在侧流条上可视化(图1cd)。如果同时检测到EN基因,则认为SARS-CoV-2 DETECTR检测为阳性;如果检测到EN基因,则认为为假阳性(图1e)。

 

1:一种基于CRISPR–Cas12的检测SARS-CoV-2的方法。

DETECTR检测反应的可视化是使用FAM-生物素报告分子和旨在捕获标记核酸的侧流条实现(图2a)。未切割的报告分子在第一条检测线(C线)处捕获,而被切割的报告分子在第二条检测线(T线)处产生信号。为了比较Cas12切割在使用荧光或侧向流动时产生的信号,研究人员使用5 fM0 fM的 N基因体外转录模板(IVT)作为检测目标,在不到1分钟的时间内即可检测到荧光信号,并在5分钟内通过横向流动获得了视觉信号(图2bc)。接下来,作者比较了RT-LAMP / Cas12 DETECTR荧光检测相对于美国FDA EUA批准的CDC检测的SARS-CoV-2检测的分析极限(LoD)(图2d)。与CDC qRT-PCR测定法相比,DETECTR横向流动测定法可轻松定性是否存在病毒。加利福尼亚公共卫生部测试的CDC分析的估计LoD为每微升1个拷贝,而DETECTR分析为每微升10个拷贝。

接下来,作者测试了从6PCR阳性的COVID-19患者(COVID19-1A / BCOVID19-5A / B)收集的11种呼吸拭子样本中提取的RNA,其中A指鼻咽拭子,B指口咽拭子, COVID19- 6指的是鼻咽拭子。使用SARS-CoV-2 DETECTR分析法从流感患者(n  = 5)和常见的人类季节性冠状病毒感染患者(n = 7OC43HKU1229ENL63)提取的12份鼻咽拭子样本进行检测并读取侧向流动条荧光强度(图2ef)。在11例患者拭子中有9例检测到SARS-CoV-2,并且未与其他呼吸道病毒交叉反应。

 

2:在人工和临床的鼻咽或口咽拭子样本中检测SARS-CoV-2

 

1:用于检测SARS-CoV-2DETECTRRT-LAMP / Cas12)分析与CDC qRT-PCR分析的比较

综上所述,该法将等温扩增与CRISPR–Cas12 DETECTR技术相结合,开发了一种快速(30–40分钟)测试方法以检测临床样品中的SARS-CoV-2,准确性与qRT-PCR相当,并使用简单的方法和可商购的“现成”试剂,为qRT-PCR测定法提供了直观,快速的替代方法。但由于DETECTR分析使用与其他qRT-PCR分析有类似的样品收集和RNA提取过程,因此在个人防护设备,提取试剂盒和试剂的可用性方面存在相同的潜在限制。与qRT-PCR相比,DETECTR的一些关键优势包括:等温信号放大消除了对热循环的需要,快速的周转时间,单核苷酸靶标特异性,简单可视化的读取方式(例如侧向流动条),并且不需要复杂的实验室基础设施。开发和验证SARS-CoV-2 DETECTR分析所花费的时间表明,该技术可以快速用于诊断新出现的人畜共患病毒的感染。

Broughton JP, Deng X, Yu G, et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020;38(7):870-874. doi:10.1038/s41587-020-0513-4

2020年7月20日 15:43
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