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核酸分子工程与纳米技术实验室

NAT COMMUN丨利用DNA折纸抗原表位捕获抗体的瞬时构象

作者:徐雪梅

介绍一篇最近发表在Nature Communications上的文章,本文通讯作者为上海交通大学的樊春海院士、中科院上海应用物理研究所的李宾教授和胡钧教授。

抗体(Ab)-抗原(Ag)的相互作用是哺乳动物免疫系统中的自然防御策略,其无可比拟的特异性识别及相互作用已被广泛用于开发临床诊断、治疗和预防的工具,例如常规疫苗预防和癌症免疫治疗。病毒可以通过调节其表面表位刺突的空间分布来逃避抗体介导的中和策略,例如HIV表面的平均表位刺突距离>20 nm,这远远超过单个抗体分子中两个Fab臂的跨度。抗体-抗原结合过程的基本机制对于免疫学非常重要,如果能在单分子水平上揭示抗体-抗原相互作用更能加深人们对免疫学的理解。目前为止,在单分子水平上揭示抗体-抗原的动态相互作用仍然很困难。过去,人们提出“锁-钥匙理论来解释抗体以高特异性结合其同源抗原的内在能力。随后,考虑Abs/Ags的瞬态构成性变化,演化出描述Ab-Ag相互作用的诱导拟合模型。低温电子显微镜(cryo-EM)作为一种可以成像单个Abs在原子级分辨率工具,为确定复杂的蛋白结构提供了有力的方式。但低温EM缺乏时间分辨能力,构象灵活性和中间Ab-Ag配合物的重要信息可能会丢失。

原子力显微镜(AFM)允许在生理条件下进行生物分子的成像,这提供了另一种途径来探测Ab-Ag的相互作用。先前的研究已经证明了AFM成像Abs的潜力和它在单分子水平定量映射Ab-Ag相互作用的纳米力学的能力。最近,高速(HS-AFM)提供了视频速率的时间分辨率,揭示了某些类型的IgGs的动态过程,如在病毒表面行走、低聚化和抗原识别后的补体激活。这些进展表明HS-AFM在解决Ab-Ag复合物的异质构象中的意义。然而,HS模式通常会牺牲空间分辨率,当然,利用AFM对瞬态功能性Ab-Ag复合物进行高分辨率成像是困难的。

在这项工作中,作者实现了在室温下,水溶液中观察到单个IgG的瞬态结合构象。利用DNA折纸表位(DOEs)来阐明免疫球蛋白GsIgGs150KDa)的瞬时结合构象。利用AFMHS-AFM和单分子FRETsmFRET),实现了在单分子水平上研究IgGs的结构、亲和性和动态结合过程。

如图1a所示,抗原表位峰在病毒颗粒表面分布不均匀,通常会影响抗体的活性。受此启发,作者设计了基于DNA折纸的模拟病毒表位的距离分布来编程抗体结合能力,如图1b所示,六对人工表位(地高辛分子,780Da)被锚定在三角DNA折纸的指定位置,并具有不同的横向间距,分别为358101620 nm。图1c展示了IgG结合到DNA折纸表面的AFM图像。AFM直观地观察到IgGsY形亮点,当表位刺突距离为81016 nm时,IgGs的三条臂清晰可见;当表位刺突距离为3520 nm时,IgGs的三条臂则无法辨别,表现出IgG对表位距离依赖性的结合行为。当横向距离为20nm时,IgG图像模糊,表明结合的IgG是可移动的。在这种情况下,横向距离超过了两臂的轮廓长度,这可能只支持IgG的单价结合。

1. 基于DNA折纸抗原表位的IgG捕获。(a)病毒颗粒表面表位刺突的非均匀分布示意图。(b)模仿病毒设计的基于DNA折纸表位(DOE)的免疫球蛋白的捕捉和结合示意图。(c)基于DOEIgG捕获AFM成像。(eIgG的一个Fc和两个Fab臂的高分辨率AFM图像及IgG的原子结构(蛋白质数据库);DNA折纸表位结合IgG中三个域(Fab蓝色和Fc红色)的AFM高度图。

接下来,作者利用HS-AFM研究DOE限制的IgG的构象灵活性。图2a表示DNA折纸表位刺突间距分别为581016 nmIgGs的动态结合AFM图像。观察所得,限制在这四个间距内的IgG均表现出摇摆运动(白色箭头方向所示)。存在两种类型的摇摆运动:平面外摆动(5 nm间距,白色圆圈)和平面内摆动(81016 nm间距,白色箭头)。前者表现为两个Fab臂紧密结合时的整体运动,而后者主要是Fc臂的运动。图2b表示在DNA折纸上锚定的地高辛对之间的间距及AFM测试的IgG的两条Fab臂之间的间距示意图。尽管IgGs是动态运动的,作者发现Fab臂重心的距离几乎是固定的,这为Fab臂的拉伸提供了一个精确的测量方法。总的趋势是,测量的距离随着表位距离的增加而增加,这表明单个IgG的两个Fab臂可以在DNA折纸锚定表位上进行可编程的拉伸。统计结果表明,在设计的地高辛对距离3581016 nm时,两个Fab臂在IgGs中的测量距离分别为4.6±1.06.0±1.08.1±1.09.7±0.811.3±1.2nm。这可能是因为测量到的距离是两个Fab重心之间的距离,比表位距离小,尤其是当两个Fab臂被拉伸时。总的来说,这项工作证明基于DNA折纸锚定的表位可以编程IgGs的拉伸状态,并在室温下对其拉伸构象进行成像。

2.a)用高速原子力显微镜(HS-AFM)表征DNA折纸表位刺突限制的IgG的构象柔度和测定的Fab-Fab距离。(b)地高辛对理论间距与AFM测试两条Fad臂的示意图。(c)理论间距与测试间距的对比统计图。

利用HS-AFM跟踪IgG结合到DNA折纸表位的过渡的过程,以此探究抗体抗原动态结合过程。作者观察到一个三阶段的DOE-IgG结合过程:(i)游荡状态,(ii)单价结合,和(iii)二价结合。图3a分别展示了表位间距为31016 nm时,IgG结合的动态AFM图像。特别是对于10 nm的表位间距,结果发现IgG分子最初在大体积溶液中游离,直到2.0 s,然后在0.5 s之内,IgG的一臂被捕获到表位刺突上,再过0.5 s,另一臂被捕获到表位上,单价结合到二价结合之间只需1 s。最终在18 s时,在表位处显示了清晰的Y形结构,表明两条Fab结合在表位刺突上,只有Fc处于游离状态。当表位间距为3 nm时,全程需85 s5 nm间距时,全程需45 s16 nm时,全程只需3 s。图3b示意了三个阶段的DOE-IgG结合过程及其成像图。接下来,作者利用全内反射荧光显微镜(TIRF)进行smFRET来验证三级DOE-IgG结合机制。图3c所示,荧光持续阶段性降低表明IgG分子从游离到单价结合再到二价结合的阶段性过程。

3. IgGDOE结合的动力学研究。(a)不同表位间距下,IgG结合到DNA折纸表位处的动态成像。(bIgG结合至表位的三阶段示意及成像图。(csmFRET验证IgG结合至表位处的阶段性过程。(d)由于两个ATTO550染料的连续漂白,单独的DOE系统显示出两步(b1b2)信号下降。

为了定量表位间距对IgG亲和性的影响,利用HS-AFM研究了IgG从单价(亲和度为1)到二价(亲和度为2)的过渡结合动力学。在不同的表位距离下,过渡时间从亚秒到100秒不等。作者发现10 nm的表位间距具有最短的一价到二价的过渡时间,且结合效率相较于其他表位间距也最高(图4a),这意味着10 nmFab间距对于二价结合来说距离最合适。较短的距离(358 nm)具有更长的过渡时间,这可能是由于空间位阻的增加。16 nm的表位间距也略微延长了过渡时间,这表明伸展两个IgG臂需要一定的松弛时间,这与先前的研究一致,即在一个抗体结构上,两个Fab臂不能拉伸超过20 nm。为了了解IgG抗原表位距离依赖性的机制,对IgG-DOE结合进行了粗粒度分子动力学(MD)模拟。模拟结果发现IgG在约9.5 nm的结合重心距离(d)处具有最低的平均力(PMF)电位,结合位点距离短或大于9.5 nm的构象都是能量不利的。特别是当距离大于15.0 nm时,平均力势显著增加。这也意味着9.5 nm或接近9.5 nm的构象发生的概率最大(图4b)。进一步利用分子动力学模拟来计算二价结合的IgG的动态构象,发现IgG的构象从高度紧凑(d=6.2nm)到远拉伸(d=16.0nm)不等。值得注意的是,测得的重心距离d小于设计的距离D。用AFM对溶液中IgG的这些瞬态构象进行成像,这些构象都是在规定的距离下捕捉到的DOEs表位距离的设计。

4. 可编程的DOE用于测定抗体活性。(aIgG-DOE单价到二价结合转变动力学的散点图(HS-AFM),以及IgG结合效率的直方图(PeakForce-AFM)。)(b)粗颗粒分子动力学计算。不同表位间距的IgG结合的计算能量图。(c)(d)用粗颗粒分子动力学计算和相应的HS-AFM图像模拟了DOE上二价结合的IgG的典型构象。

结论:在这项研究中,作者利用DNA折纸的空间寻址能力,设计了模拟病毒颗粒上表位距离分布的DOEDOEs的定位能力和刚性可使IgG在室温下被捕获,并在单分子水平上对瞬时的、功能性的IgG结合构象进行高分辨率成像。DOE平台为IgGs在室温下的瞬时功能构象提供了直接的结构证据,这可能加深人们对生理或病理相关Ab-Ag复合物的理解。其可设计性和可编程性为模拟病毒表位分布提供了一种直观的方法,不仅增加了在单分子水平上理解抗原抗体相互作用的设计空间,而且还为工程免疫工具提供了一个潜在的平台。

Ping Zhang, Xiaoguo Liu, Pi Liu, Fei Wang, Hirotaka Ariyama, Toshio Ando, Jianping Lin, Lihua Wang, Jun Hu, Bin Li, Chunhai Fan. Capturing transient antibody conformations with DNA origami epitopes. Nature Communications, 2020, 11, 3114.

2020年7月2日 17:51
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