ANGEW丨DNA编辑红细胞上T细胞激活配体用于过继免疫治疗

作者：齐力轻

表面锚定T细胞活化配体的人工抗原提呈细胞(APCs)在过继免疫治疗中具有很大的潜力。然而，利用传统的生物偶联化学方法来精确控制配体定位仍然是一个挑战。本研究利用DNA自下而上自组装来精确控制T细胞激活配体在红细胞上的横向和纵向分布。研究发现，当红细胞RBC上的抗原肽-MHC分子复合物(pMHC)和RBC细胞膜之间具有较短的垂直距离时更有利于实现有效的T细胞活化，这有可能归功于它们可以更好地模拟天然的APCs。这种优化的基于RBC的人工APCs可以通过过继性免疫治疗在体内刺激T细胞增殖，进而有效抑制肿瘤生长。这一研究表明DNA技术可以精确地设计细胞膜界面和调整细胞与细胞之间的相互作用，有望在包括免疫治疗在内的更多领域实现广泛应用。

 

Scheme 1|DNA技术允许在红细胞的横向和纵向上精确调节T细胞激活配体，构建在T细胞激活方面性能最佳的aAPCs。

红细胞在体内含量丰富，易于提取，具有高度的生物相容性，在血液中循环时间极长，且比表面积、膜柔度等物理性能更接近天然APCs。所有这些特性使RBCs成为T细胞激活方面的理想平台。本文利用脂质结合具有不同序列的DNA来修饰RBCs，通过DNA介导的分子组装控制调节T细胞激活配体的分布。通过改变DNA长度来调整pMHCs与红细胞膜的间距，结果发现当间距变短时更有利T细胞的激活。

 

Fig1 |DNA杂交介导pMHCs和aCD28在红细胞上均匀分布用于激活T细胞。(A) DNA杂交介导的pMHCs和aCD28在红细胞上的均匀组装示意图。(B) 5’ chol-DNA1-3 ‘Cy5分布均匀的红细胞共聚焦荧光图像。(C) pMHC-atto488在红细胞上分布均匀的共聚焦荧光图像。(D) aCD28-alexa647在红细胞上分布均匀的共聚焦荧光图像。(E)流式细胞仪数据验证CD4+ T细胞增殖状况。(F)流式细胞术数据验证CD8+ T细胞增殖状况。(G)分别对应(E)、(F)的CD4+ T细胞增殖和CD8+ T细胞增殖的统计数值。

本研究利用两种不同序列的胆固醇功能化的DNA将pMHCs和aCD28锚定在红细胞表面。首先，通过修饰有胆固醇的DNA (chol -DNA)与红细胞孵育，使其可以快速插入细胞横向分布均匀的红细胞膜，然后pMHC和aCD28可以通过特异性DNA杂化组装到红细胞上。研究发现，pMHC和aCD28可以在红细胞表面稳定存在超过12小时，这对于T细胞的激活来说已经足够。据研究表明，在受到刺激后，T细胞增殖相关基因的表达只需要2小时左右。

 

Fig2 |DNA介导在红细胞上非均匀组装T细胞激活配体。(A-D) DNA介导在红细胞上非均匀组装pMHC和aCD28示意图。(E)5’chol-DNA1-3’Cy5在红细胞上分布均匀的共聚焦荧光图像。(F)在亲和素上标记 atto488的红细胞共聚焦荧光图像。(G)群簇pMHC标记atto488的红细胞共聚焦图像。(H)在CD28抗体上标记alexa647的均匀分布在红细胞上的共聚焦图像。

通过DNA定向自底向上自组装实现pMHC和aCD28的横向不均匀分布。对于pMHCs的组装和定位控制，研究使用胆固醇和生物素双标记DNA1 (30bp)实现红细胞的生物素装饰，生物素和atto488标记的pmhc通过生物素-亲和素结合，组装到红细胞上。由于每个亲和素上有4个生物素结合位点，推测出生物素-亲和素的多重相互作用会使pMHC交联，导致pMHC横向不均匀分布。由共聚焦荧光成像显示，修饰后的RBC表面形成了pMHC群簇，类似于天然APCs上的pMHC簇。

 

Fig3 |激活配体在红细胞上的横向不均匀分布能更有效地刺激T细胞增殖。(A) RBC细胞膜上pMHCs和aCD28均匀分布示意图。(B) RBC细胞膜上pMHCs和aCD28均匀分布的共聚焦图像。(C)细胞膜上pMHCs和aCD28不均匀分布示意图。(D)显示RBC细胞膜上pMHCs和aCD28不均匀分布的共聚焦图像。(E) pMHC与TCR的单价相互作用示意图。(F) pMHC与TCR多价相互作用示意图。(G)流式细胞术CFSE稀释法显示不同处理下CD8+ T细胞增殖数据。(H)基于流式细胞术结果的不同处理CD8+ T细胞增殖的统计数据(G). (I)不同处理组细胞培养上清中TNF-和(J) IFN- H水平。图G-H中的c表示群簇。使用30 bp的DNA1将pMHC锚定在红细胞上。

首先探讨了红细胞表面pMHCs密度对T细胞增殖的影响。之后探究红细胞膜上T细胞活化配体的横向分布对红细胞T细胞活化能力的影响。通过将两种基于RBC的aAPCs分别与OT-I小鼠的脾细胞孵育三天。CFSE稀释实验显示， pMHC和aCD28分布不均匀的RBC型aAPCs对CD8+ T细胞增殖的促进作用更明显。同时，酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，配体分布不均的RBC型aAPCs组与CD8+ T细胞增殖相关的炎性细胞因子(TNF-和IFN-脂质体)的分泌量也明显高于配体分布均匀的RBC组。

 

Fig4 |短距离的pMHC与红细胞膜可以更有效地活化T细胞。(A) 通过改变DNA长度调整pMHC群簇与红细胞膜的垂直距离示意图。(B)pMHC群簇和aCD28分布不均匀的红细胞共焦图像。在该样本中，pMHC群簇使用缩短的DNA (8 bp)在红细胞膜上组装。(C)当DNA1缩短(8 bp)时，pMHC与RBC膜之间的距离也会缩短，从而使atto488与DiL之间产生荧光共振能量转移。(D& E)荧光发射光谱显示没有产生荧光共振能量转移和(D)有明显荧光共振能量转移 (E)。(F&G)。当pMHC团簇与RBC膜之间的距离缩短，T细胞膜和RBC膜之间的距离随之缩短示意图。(H)CFSE稀释显示不同处理下CD8+ T细胞增殖的流式细胞仪数据。(I)基于H图中不同处理的CD8+ T细胞增殖情况。不同处理组细胞培养上清中(J) TNF-和(K)IFN- H水平的统计数据。图H-K中的c表示簇。

作者认为细胞受体配体的聚集分布可能提高receptor-ligand绑定效率，更好的触发T细胞增殖相关信号通路。通过调控pMHC与红细胞膜的垂直距离，进一步优化基于RBC的aAPCs。根据运动分离模型，APCs向T细胞呈递抗原时，T细胞的膜会在TCR-pMHC相互作用区域形成突起。这种结构被认为能够使具有长胞外结构域的磷酸酶CD45远离CD3复合物，从而维持CD3复合物的活化状态。因此接下来通过改变使用的DNA的长度来控制激活配体与细胞膜的距离，使得pMHC与TCR结合时T细胞膜更接近红细胞膜。随后，探讨了pMHC簇与红细胞膜的距离对T细胞活化的影响。文章将两种基于RBC的aAPCs分别与OT-I小鼠脾细胞孵育3天，发现当pMHC聚集物靠近RBC膜时，T细胞的活化和增殖能力进一步增强，CFSE稀释法显示。此外，ELISA检测结果显示，以RBC为基础、pMHC聚集物更靠近细胞膜的APCs组，与CD8+ T细胞增殖相关的炎性细胞因子(TNF- TNF-和IFN- h)的分泌量似乎更高。这些结果与Dustin等人之前的研究一致，他们发现TCR配体越靠近平面底物越有利于TCR的触发。值得注意的是，在本研究中，配体定位调节是在自然细胞的表面进行的，与固体底物相比，这将更好地模拟自然APCs。

 

Fig5 |优化的RBC-based aAPCs 刺激的脾细胞显示出更高的CD8+ CTLs百分比和更强的体外靶向癌细胞杀伤。(A)扩增CD8+ CTLs体外杀伤肿瘤细胞的实验示意图。(B)流式细胞仪数据显示，经 OT-I 小鼠初生脾细胞和RBC-based aAPCs（固定有30 bp DNA1连接的群簇pMHCs和经8 bp DNA1连接的群簇pMHCs）激化的脾脏细胞中CD8+ T细胞的含量较高。(C)单纯的OT-I小鼠脾脏细胞、均匀分布的RBC-based aAPCs 或有群簇的RBC-based aAPCs 活化的脾脏细胞特异性裂解的效果。(D)流式细胞术数据显示，在固定有短距离的pMHCs的RBC-based aAPCs刺激下，脾脏细胞中CD8+ T细胞的百分比较高。(E)经 OT-I 小鼠初生脾细胞和RBC-based aAPCs（固定有30 bp DNA1连接的群簇pMHCs和经8 bp DNA1连接的群簇pMHCs）激化的脾细胞的癌细胞特异性裂解效果。图B-E中的c表示簇。

应用工程T细胞活化平台(aAPCs)进行体内肿瘤抗原特异性T细胞扩增，可能有利于过继免疫治疗。通过直接激活T细胞，绕过自然抗原递呈过程(如APCs的成熟和迁移)，这些aAPCs可能能够诱导更快的抗肿瘤免疫应答。因此，本研究尝试将经过优化的基于RBC的aAPCs与靠近细胞膜的pMHC簇结合，在小鼠体内扩增OVA257- 264肽特异性T细胞，实现过继性肿瘤免疫治疗。结果显示，固定有pMHC簇的aAPCs刺激脾细胞的CD8+ T细胞比例高于均匀分布的活化配体aAPCs刺激脾细胞的CD8+ T细胞比例。此外，靠近细胞膜(8-bp DNA1)的aAPCs刺激脾细胞的CD8+ T细胞比例高于远离细胞膜(30-bp DNA1)的aAPCs刺激脾细胞的CD8+ T细胞比例。因此，优化后的aAPCs利用靠近细胞膜(8- bp DNA1)处的pMHC簇刺激脾细胞，可以更有效地杀伤靶向B16-OVA细胞.

 

Fig6 |经优化的RBC-based aAPCs在激活体内T细胞增殖和过继免疫治疗。(A)体内T细胞扩增和检测的实验示意图。(B)CFSE稀释显示不同处理下CD8+ T细胞在体内的增殖情况。(C)根据(B)中流式细胞术结果统计不同处理下CD8+ T细胞增殖情况。(D)固定有群簇的pMHC的RBC-based aAPCs在在更短距离(8-bp DNA1)到细胞膜的过继免疫治疗的实验步骤。(E)不同治疗组肿瘤生长曲线(每个治疗组6只小鼠;n = 6)。(F)不同处理组的生存曲线(n = 6 /组)。

之后进一步研究优化后的RBC-based aAPCs可以刺激OT-I小鼠体内CD8+ T细胞的增殖。通过从OTI小鼠中获得脾细胞，并用CFSE染色。然后将染色细胞与aAPCs以2:1的比例混合，注射到C57小鼠体内。6天后，取C57小鼠脾脏细胞，流式细胞术检测抗原特异性CD8+ T细胞增殖。发现抗原特异性CD8+ T细胞在注射aAPCs组中增殖明显，与未注射aAPCs组形成明显对比。此外，应用RBC-based aAPCs进行过继免疫治疗，以治疗B16- OVA肿瘤模型。在肿瘤植入后第7天，开始同时静脉注射OT-1小鼠的脾细胞和优化RBC型aAPCs。密切监测肿瘤生长和小鼠存活率。结果发现注射RBC-based aAPCs组小鼠对肿瘤的生长抑制作用更明显，小鼠延长存活时间明显变长，展示了优秀的过继免疫治疗效果。

 综上所述，本文利用脂质-DNA调控RBC表面的激活配体分布构建aAPCs，发现第一信号pMHCs和共刺激信号aCD28的不均匀分布有利于T细胞的活化。此外，pMHCs与红细胞膜的距离越近，对T细胞激活效果越好，能更有效地刺激抗原特异性T细胞在体内增殖，并在过继免疫治疗中获得较大的肿瘤抑制反应。此外，作者提出利用DNA技术在活细胞膜上精确定位生物分子可以扩展到不同类型的细胞，可以实现本研究中所展示的免疫治疗之外的其他有趣应用。

Zhuang Liu, Lele Sun, Fengyun Shen, Jun Xu, Xiao Han, and Chunhai Fan.DNA-Edited Ligand Positioning on Red Blood Cells to Enable Optimized T Cell Activation for Adoptive Immunotherapy. Angew. Chem. Int. Ed. 10.1002/anie.202003367