NAT METHOD丨RNA核酸适配体抑制荧光蛋白降解用于mRNA的实时成像

 

作者：汪俊彦

本文通讯作者Samie R. Jaffrey是美国康奈尔大学康奈尔医学院教授，长期从事mRNA的m6A修饰及RNA荧光核酸适配体等方面的研究工作。

 

本文作者设计了一个名为tDeg的短肽序列 (SGPRPRGTRGKGRRIRRRG)，其中包含一个核酸适配体TAR的结合短肽Tat，和一个能够募集蛋白酶体的降解子四肽，当TAR结合tDeg后，能够抑制降解子的功能，阻止蛋白酶体降解蛋白。

为了验证和优化上述系统，作者在细胞内表达了C端包含tDeg短肽的荧光蛋白EYFP (EYFP-tDeg) 和不同突变体的核酸适配体TAR。结果表明，只表达EYFP-tDeg不表达TAR的对照细胞内，EYFP-tDeg蛋白几乎全部降解；而同时表达了核酸适配体TAR和EYFP-tDeg蛋白的实验组细胞内，TAR明显抑制了EYFP-tDeg蛋白的降解，其中核酸适配体TAR的2号突变体效果最佳，作者将其命名为Pepper RNA。为了验证tDeg-Pepper系统是否有通用性，作者还在mNeonGreen、mCherry、NanoLuc等蛋白的C端加上了tDeg短肽，发现Pepper RNA也能够抑制这些蛋白在细胞内的降解。

 

图1. RNA调控蛋白稳定性的设计和优化。a，Pepper RNA调控蛋白稳定性示意图。b，Pepper RNA抑制EYFP-tDeg蛋白的降解。c，无EYFP蛋白表达的HEK293T细胞、表达EYFP的HEK293T细胞、同时表达EYFP-tDeg蛋白和不同RNA的HEK293T细胞的相对荧光强度

最后，作者将tDeg-Pepper系统应用于细胞内mRNA的成像。同时在细胞内表达了，3’ UTR上包含20个Pepper RNA序列的靶标mRNA，和C端添加了tDeg短肽的绿色荧光蛋白mNeonGreen (mNeonGreen-tDeg)；自由的mNeonGreen-tDeg蛋白会被细胞内的蛋白酶体迅速降解，从而失去绿色荧光；只有结合到靶标mRNA的Pepper RNA上，mNeonGreen-tDeg蛋白才不会被降解，保持绿色荧光，实现对靶标mRNA的荧光成像分析。

 

图2. Pepper RNA调控多种tDeg标签蛋白的稳定性。

 

图3. tDeg-Pepper系统用于细胞内β-actin mRNA的荧光成像分析。

虽然，作者只是将tDeg-Pepper系统用于了mRNA的原位成像，但是此系统可以控制tDeg标签蛋白的降解，所以还能够用于精确控制蛋白的功能以及其它合成生物学应用。

Wu J, Zaccara S, Khuperkar D, Kim H, Tanenbaum ME, Jaffrey SR. Live imaging of mRNA using RNA-stabilized fluorogenic proteins. Nature methods. 2019;16(9):862-5. Epub 2019/09/01. doi: 10.1038/s41592-019-0531-7. PubMed PMID: 31471614; PMCID: PMC6719798.