NAT BIOMED ENG丨基于一锅法恒温连接和转录反应实现临床样本的SARS-CoV-2高灵敏荧光检测

作者：李好问

随着传染性疾病的频繁出现和快速传播，且一些威胁生命的传染病往往具有类似于感冒或者流感样综合征的体征和症状。因此，早期诊断对于识别疾病及提供正确的治疗至关重要。同时，快速的现场诊断有助于防止流行和大流行传染病的传播。为了快速诊断传染病，基于核酸的诊断由于其快速和特异性的特点已经成为传统培养或免疫分析的替代方法。为了增加其灵敏度，目前的核酸检测方法通常都是在检测步骤之前进行目标扩增。传统的扩增方法是基于PCR，这需要一个热循环仪进行精确的温度调节。而替代的等温扩增依赖恒定温度下的链置换酶或T7 RNA聚合酶。然而，这种方法由于反应体系的复杂性使得检测成为多步骤过程，需要较多的时间、仪器、试剂以及熟练的人员来实现检测，这极大的限制了核酸诊断的广泛性应用。如何克服这些限制，实现等温扩增后的简单快速的精准检测？

近日，韩国的浦项科技大学的Gyoo Yeol Jung和Jeong Wook Lee团队等人在国际学术期刊《自然-生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering.）上发表研究论文《Sensitive fluorescence detection of SARS-CoV-2 RNA in clinical samples via one-pot isothermal ligation and transcription》，报道了基于一锅法恒温连接和转录反应实现临床样本的SARS-CoV-2高灵敏荧光检测。

在本研究中，作者开发了一种基于高灵敏度的一锅等温RNA检测（SENSR）。SENSR由两个简单的酶促反应组成：通过SplintR连接酶进行连接反应后通过T7 RNA聚合酶进行转录反应。在SENSR中，通过一组寡核苷酸探针, SplintR连接酶，T7 RNA聚合酶和一种荧光染料分子组成一个联级反应实现一锅法快速检测。加入病原体来源的RNA样品后，连接、转录和染料-适体结合的反应步骤分别可以检测、扩增和产生信号。如图1所示，设计了两个单链DNA探针，分别为启动子探针和报告探针。启动子探针由上游杂交序列（UHS）和茎环结构的T7启动子组成。UHS与目标RNA的5’端进行一半序列杂交，T7启动子部分形成茎环结构形成活性双链。报告探针由下游杂交序列（DHS）和染料结合的RNA核酸适体模板序列组成。当UHS和DHS探针与目标RNA杂交后，SplintR连接酶将启动子探针和报告探针连接起来。随后，T7 RNA聚合酶利用全长的连接探针作为DNA模板合成RNA适配体，适配体与荧光染料结合发出荧光。SENSR的反应具有两重信号放大机制：（1）T7 RNA聚合酶连接全长探针的多重转录反应；（2）目标RNA序列对全长探针的连接反应。因此，SENSR无需任何预扩增步骤可以实现对RNA的高灵敏检测。

 

图1.  SENSR示意图

依据SENSR过程，作者首先设计了一对靶向MRSA mecA转录物的探针，进行了三个组分反应的构建，通过实验证明只有当SENSR中每个组分都存在的情况下才可以实现目标RNA的检测，如图2所示。

 

图2.  SENSR的三组分反应的构建

紧接着，作者使用MRSA的RNA作为目标模型，优化SENSR的反应条件，发现在30分钟的反应时间内检测限可以达到0.1 aM，如图3所示，该方法实现了快速、灵敏的目标RNA检测。

 

图3.  SENSR的检测灵敏度及检测时长

基于上述实验结果，该方法仅需设计核酸序列即可构建分子诊断平台，适用于传染病的检测诊断。如图4所示，作者首先对两种病原微生物：V. vulnificus和E. coli O157:H7，分别设计靶向两种病原微生物的特异性基因vvhA和tir的探针，使用SENSR的联级反应监测均实现了目标RNA的0.1 aM的高灵敏度检测，将该方法扩展到引起致命性疾病的RNA病毒：MERS-CoV, Influenza A和SARS-CoV-2，分别设计靶向三种病毒的特异性基因upE, HA和SARS-CoV-2-MG1的探针，使用SENSR的联级反应监测均实现了目标RNA的0.1 aM的高灵敏度检测，证明了该方法的高度适用性。

 

图4.  SENSR的广泛适用性

在标样体系中已经实现了高灵敏度的精准检测，接下来，作为使用SENSR直接进行病原体活细胞中RNA样本检测。将MRSA和MSSA细胞裂解液中的RNA进行直接检测，如图5所示，获得了高灵敏度和特异性，证明该方法同样适用于实际样品的检测。

 

图5.  活细胞和模拟的临床样品的SENSR检测。

由于MRSA感染会引起流感样症状，因此需要将这种病原体与普通的甲型流感病毒进行区分，同时检测和鉴别这两种病原体，可以提供正确的治疗方式。如图6所示，设计了两个正交反应的SENSR探针来检测两种目标RNA。作者采用Broccoli核酸适体模板替换核酸适体模板区，设计了甲型流感病毒的正交报告探针。Broccoli核酸适体结合DFHBI-1T会发出荧光，并且与孔雀石绿适体的光谱特性不同，从而可以进行正交反应。通过对不同浓度的目标RNA检测，作者实现了两种病原体的正交双检测。

 

图6.  多靶向RNA的SENSR检测。

最后，作者将SENSR体系的正交检测方法用于SARS-CoV-2的检测。由于SARS-CoV-2具有许多高度同源序列的相关病毒，对不同靶点的同时检测更容易将该种病原体与其病原体区别开来。如图7所示，除了前面检测时设计的SARS-CoV-2探针对，作者还设计了三个用于RdRp基因的三个不同区域的检测探针对，所有四对探针都能检测到1 aM的SARS-CoV-2 RNA。作者设计了基于SARS-CoV-2的双探针检测体系，实现了特异性检测目标RNA的目的，可用于辅助诊断。

 

图7.  SARS-CoV-2的SENSR的正交检测

为了验证了SENSR在临床样本中检测COVID-19的可行性。如图8所示，为了简化检测流程，分别使用热裂解或化学裂解法直接从临床样本中获得粗病毒裂解物。作者首先通过热裂解流程检测40个样本（20个阳性和20个阴性），与rRT–PCR结果相比，SENSR检测结果显示阳性预测的一致性为85%（20个样本检测出17个），阴性预测的一致行为100%（20个样品检测出20个）。使用另一对探针能够将错误预测为阴性的3个样本检测出来，提高阳性率到95%。接着作者使用化学裂解流程检测20个样品，与rRT–PCR结果相比，分析结果为阳性预测的一致性为80%（10个样本检测出8个），阴性预测的一致性为100%（10个样品检测出10个）。验证了SENSR作为快速诊断测试的可行性。

 

图8.  SARS-CoV-2的临床样本的SENSR检测。

该研究证明了SENSR是一种用于RNA检测的强大诊断技术，可以在较短的时间内实现高灵敏度和特异性的快速检测，并且无需昂贵的仪器和诊断专家。由于探针设计过程简单且发展迅速，SENSR将在新兴传染病的诊断中发挥巨大的潜力。

Chang Ha Woo, Sungho Jang, Giyoung Shin, Gyoo Yeol Jung* & Jeong Wook Lee*. Sensitive fluorescence detection of SARS-CoV-2 RNA in clinical samples via one-pot isothermal ligation and transcription. Nature Biomedical Engineering, DIO: 10.1038/s41551-020-00617-5.