CELL丨超特异性核糖调节子实现精确且可编程的突变检测
作者：杨林林
本文通讯作者为美国亚利桑那州立大学的Alexander A. Green和Hao Yan教授。Alexander A. Green课题组在合成生物学、诊断学和纳米技术领域进行跨学科研究，包括：使用计算机软件工具从头设计RNA分子，这些分子可对刺激做出反应并在活细胞中执行生物分子程序；设计可用于检测的核酸分子，以开发便携、低成本且易于使用的测定方法；研究自组装纳米结构和纳米材料的合成，并探讨其作为催化剂和抗菌剂的应用。
RNA作为遗传信息传递和表达的关键一环，携带着重要的差异信息，精确识别RNA所携带的突变、化学修饰等变化情况，对细胞生物学、疾病检测和临床诊断等有重要意义。核糖调节子（Riboregulators）作为高特异性分子探针在体内或即时检测方面具有巨大的潜力。但是目前已报道的Riboregulators还不能识别单个核苷酸的变化，本文作者开发了一种单核苷酸特异且可编程的核糖调节子（single-nucleotide-specific programmable riboregulator, SNIPR），能够精准检测原核细胞中的单碱基突变和体外无细胞系统的单碱基修饰。
图1 SNIPR设计及检测原理
设计这个系统的首要原则，就是要基于靶RNA序列差异性来实现高度特异的翻译调控。本文作者设计的SNIPRs包含一个发夹结构，在茎的两端有一对正向和反向tohold。OFF状态时，核糖体结合位点RBS被隐蔽在发夹结构中的环里（loop），起始密码子与反向tohold相配对，阻止了核糖体的识别。存在靶RNA时，单链正向tohold在docking site的带领下结合到靶RNA上，促进茎的打开。此时，仅剩对靶RNA不互补的反向tohold区域保持配对状态，但是足够短能被同时打开，并暴露RBS和起始密码子，从而激活下游报告基因的翻译表达。这个OFF到ON的转变过程是由自由能的改变决定的，因此可以通过调整tohold的长度和序列进行操纵。而且针对突变的靶RNA，反向平衡区的序列可以在反向tohold的带动下，重建发夹结构，激活事件不会发生。基于这个原理，作者将SNIPRs的状态改变和序列特异性结合起来，对完美匹配的野生型靶RNA，OFF和ON状态的自由能改变相差-1 kcal/mol，让SNIPRs偏向ON状态。如果靶RNA是带有突变位点的，一个错配就会让发夹结构的双链区域自由能改变4 kcal/mol，结果是+3 kcal/mol的能量使得平衡偏向了OFF状态，靶RNA的ON状态形成比单碱基突变RNA高出100倍以上。为了评估SNIPR的识别性能，作者在大肠杆菌体内用质粒表达SNIPRs和靶RNA，以GFP作为输出蛋白。结果5条靶RNA组的分化因子都超出100（图1D），也就是突变靶RNA组只产生了正确靶RNA组1%的蛋白量。作者还在体外实验中也检测了这个系统，分化因子从5-38不等，比体内实验要低。
图2 SNIPRs可体外区分靶RNA修饰
从理论上讲，在化学平衡附近工作的核糖调节子不仅对靶序列的变化非常敏感，而且对改变反应自由能并导致平衡发生变化的任何靶修饰都非常敏感。作者继续评估用于具有化学修饰碱基但序列相同的靶RNA的SNIPR系统。研究使用了在特定位置具有N6-甲基腺苷(m6A)和2’-O-甲基化(2’-OMe)修饰的RNA序列。据报道，m6A修饰降低RNA双链稳定性，而2’-OMe修饰增加双链稳定性。因为SNIPRs的识别能力依赖于RNA双链的热稳定性，预测m6A更有可能抑制基因表达，2’-OMe更有可能促进基因表达（图2A）。作者在cell-free的转录-翻译系统中进行测试。结果显示，随着靶RNA中m6A修饰碱基的增加，SNIPRs产生的GFP逐渐减少（图2B）。因为m6A修饰增加了反应能量，并导致平衡向OFF状态移动。证明SNIPR能够至少分辨SNV敏感区的两个m6A碱基。鉴于2’-OMe修饰增加了双链稳定性，所以设计成与目标RNA序列具有单错配的SNIPR被用于确保没有任何修饰的靶RNA的低产量。图2C所示，单修饰可以基于GFP产量的增加来区分，因为2’-OMe修饰增加了双链稳定性，并有助于克服SNIPR和靶RNA之间的错配造成的能量劣势。随着SNV敏感区碱基修饰数量的增加，GFP的表达量也进一步增加。
图3 无细胞系统中的SNIPR设计自动化和快速成型
SNIPR精准的特异性检测能力意味着能量平衡区的任何破坏都会影响它们的识别性能。为了方便SNIPR的设计，作者开发了一种基于NUPACK的设计算法生成和筛选SNIPR序列以获得预期的突变特异性检测能力。简而言之，考虑待区分的靶突变和野生型(WT)序列以及输出蛋白的序列后，生成具有不同正向和反向toehold长度的SNIPR设计库（图3A）。为了评估这一设计，作者生成一组针对HIV逆转录酶（RT）基因10个不同突变的SNIPR，包括与核苷RT抑制剂(NRTI)耐药性增加相关的c.550A>U突变(M184V)。通过调节不同长度的正向和反向tohold序列组合的SNIPR反应能量来补偿很多不确定性，以实现最大的序列分辨。图3B-D结果显示，9个组合中大多数设计在GFP荧光强度方面的区分因子大于2. 图2E显示了筛选后的10个SNIPR，这些SNIPR能够在HIV RNA序列中区分它们相应的靶突变。针对与癌症、遗传性疾病血色素沉着症、疟疾寄生虫恶性疟原虫中的青蒿素抗药性以及耐NRTI的艾滋病毒相关的临床相关突变进行测试，所有突变组产生的信号都明显高于相应的WT组信号，SNIPR能够区分这些突变。
为了提供一个比色检测读数，利用SNIPRs来表达编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ。在有相应底物时，这个酶可以产生紫色产物。这种颜色变化是肉眼可见的，因此当与纸盘上的cell-free转录-翻译反应结合时，可以产生简单的比色分析。以lacZ为输出基因，对多种临床突变进行比色检测。只有突变的RNA靶点才能引起紫色的变化，而WT靶点则保持了原有的黄色底物颜色。
图4 SNIPR应用于人类基因分型
作者从与三种不同疾病密切相关的不同位点选择了三个突变（图4A），并使用杂合子和纯合子的人类基因组样本评估SNIPR识别遗传疾病的可能性。以缺乏上述所有突变的基因组样本(NA16660)作为WT对照。图4C-4E所示，包含靶突变的样本比从WT样本产生的荧光信号要高得多。此外，在血色素沉着症和囊性纤维化中，GFP荧光强度足以区分杂合携带者和纯合子携带者，纯合子样本提供了更高的信号。因此，SNIPR有能力区分将患有这些遗传性疾病的无症状杂合子携带者和纯合子携带者。对于囊性纤维化相关靶RNA，作者还测试了lacZ比色方法。如图4F-4H所示，杂合样本可以诱导突变体和WT的SNIPRS传感器由黄变紫，而WT样本和纯合子样本只能分别实现WT和突变体特异性SNIPR的颜色变化。
图5 Zika菌株的等温扩增和基于恒温纸片SNIPR系统的单核苷酸突变检测
SNIPR系统cell-free反应37℃操作温度使其能够用于便携式、低成本的分子诊断。作者将SNIPR与重组酶聚合扩增(RPA)反应相结合，测试了从非洲、美洲和亚洲提取的起始浓度为~10fM的Zika病毒的基因组RNA样本。三个Zika病毒株的靶RNA之间的序列差异出现在多个位置（图5B），Zika病毒株在应用于其相应的菌株特异性SNIPR时，都会引起预期的从黄色到紫色的颜色变化，但与非互补的SNIPR相比，颜色变化很小（图5C），并且肉眼就能看出这种变化（图5D）。通过RT-RPA扩增，毒株特异的SNIPR可以用来检测浓度为250 am的Zika病毒RNA片段，足够用于临床样本中的检测。
最后，作者还将这个体系应用于临床血液样本。采集自两名BRCA2基因突变的个体和一个该基因野生型个体。首先用血液DNA提取试剂盒从全血中提取DNA，通过RPA扩增，然后应用于纸上进行SNIPR检测，BRCA2c.8904delC和BRCA2c.8167G>C(图5F,G)可以通过变色反应很容易地识别出来。相比之下，用WT血样进行的检测通过1 h的无细胞反应保持了它们的黄色。
本文开发了一类翻译核糖调节子，能够在大肠杆菌活细胞内和无细胞转录-翻译反应中提供超特异的RNA检测能力。无细胞体系中的反应表明，SNIPRs表现出单核苷酸水平以外的特异性，可以根据表观转录修饰区分转录本，对单个甲基化位点做出反应。将计算机设计的SNIPR应用于临床相关的耐药突变、癌症、病毒株鉴别和纸质反应中的人类基因分型，提供了肉眼可以辨别的明确的比色结果。
Fan Hong, Duo Ma, Kaiyue Wu, Lida A. Mina, Rebecca C. Luiten, Yan Liu, Hao Yan and Alexander A. Green. Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.011
