SCIENCE丨CRISPR-CasΦ：来源于巨大噬菌体的一种超紧凑的基因编辑器
作者：徐雪梅
本篇Science介绍了一种新型的基因编辑工具—CRISPR-CasΦ。CasΦ蛋白仅为Cas9和Cas12a分子量的一半，具有超紧凑的CRISPR array，被证明可用于体外和体内的基因编辑。本文通讯作者是CRISPR的开创者之一，来自于UC Berkeley的 Jennifer Doudna教授。Doudna教授课题组主要从事CRISPR-Cas蛋白的结构解析与机理研究，开发新型基因编辑工具以及利用CRISPR-Cas系统作为编辑植物和哺乳动物基因的工具以更好地防治人类疾病和培育抗病的作物等。
病毒与其宿主微生物之间的竞争促进了CRISPR- Cas系统的进化，该系统利用核酸酶和非编码CRISPR RNA (crRNAs)通过碱基互补配对靶向外来核酸。CRISPR array转录体（包括从病毒或其他可移动遗传元件(MGEs)获得的重复序列和间隔序列）经过处理生成成熟的crRNAs，引导Cas蛋白识别并破坏之前遇到的病毒DNA。先前CRISPR-Cas系统几乎只在微生物基因组中发现，但最近发现的普遍存在的巨型噬菌体(细菌病毒)也揭示了它们基因组中编码的CRISPR-Cas系统。这些系统具有紧凑的CRISPR阵列（每个阵列平均有5个间隔区），其中一些靶向竞争噬菌体或噬菌体宿主的基因。CasΦ（Cas12j）是在Biggie噬菌体中编码的Cas蛋白家族分支中的一个。CasΦ包含一个C端RuvC结构域，与TnpB核酸酶超家族的结构域具有远程同源性，V型CRISPR Cas蛋白就是从这个超家族进化而来的。然而，CasΦ与其它V型CRISPR-Cas蛋白仅具有<7%的氨基酸同源性（Figure 1A）。
CasΦ的尺寸非常小，约为70-80kDa，大约是Cas9和Cas12a大小的一半（Figure 1B）。作者研究了三个不同的CasΦ同源序列，CasΦ-1、CasΦ-2和CasΦ-3。为了确定CasΦ是否使用PAM，一个包含与crRNA互补靶位点相邻的随机区域的质粒库转染至细菌中，用于耗尽含有功能性PAM的质粒。结果证明，crRNA具有引导CasΦ靶向双链DNA（dsDNA）的能力，并揭示了最小的富含T的PAM序列，包括5′-TBN-3′PAMs（其中B是G、T或C）被CasΦ-2耗尽（Figure 1C）。接下来作者使用大肠杆菌表达系统和质粒干扰试验来确定CRISPR-CasΦ系统功能所需的成分。RNA测序分析显示了casΦ基因的转录和CRISPR阵列的减少，但没有发现其他非编码RNA，如基因位点内的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）的参与该过程（Figure 1D）。此外，通过改变引导RNA，CasΦ的活性可以很容易地重新编程用以靶向其他质粒序列。这些发现表明，在其自然环境中，CasΦ是一种功能性噬菌体蛋白和CRISPR-Cas效应器，能够切割crRNA互补的DNA，如其他噬菌体的DNA（Figure 1E）。此外，这些结果表明该单RNA系统比其他活性CRISPR-Cas系统更加紧凑，具有最小的RNP复合物分子量（Figure 1F）。
图1. CasΦ是一个来自巨大噬菌体的CRISPR-Cas系统。（A）V型效应蛋白的最大似然系统发育树及其预测的祖先TnpB核酸酶。（B）CasΦ，Cas14基因组及先前在基因工程应用中常用的CRISPR-Cas系统基因图解。（C）三个CasΦ正交测井曲线的PAM消耗分析和结果PAMs的图形表示。（D）RNA结果映射到CasΦ原代基因组及其上游和下游非编码区，用还原CRISPR阵列克隆到表达质粒中。（E）巨大噬菌体编码的CasΦ在其宿主重叠感染的一个实例中的假设功能示意图。CasΦ可能被巨大的噬菌体用来消除竞争的可移动遗传元件。（F）CRISPR-Cas效应器RNP复合物的预测分子量。
接下来作者在体外研究了CasΦ的DNA识别和切割要求。RNA测序显示，与DNA靶点互补的crRNA间隔区有14~20nt长（图1D）。将纯化的CasΦ与不同间隔区大小的crRNAs以及超螺旋质粒或线性dsDNA孵育，结果表明，DNA裂解需要同源PAM和≥14nt的间隔区存在（图2A）。对DNA裂解产物的分析表明，CasΦ产生了8~12nt的交错5′-overhang（图2B和2C）。体外实验证明，CasΦ-2和CasΦ-3在体外比CasΦ-1更活跃，并且在RuvC活性位点内非靶链（NTS）比靶链（TS）断裂更快（图2D）。此外，研究发现CasΦ还可以切割单链DNA（ssDNA），但不能切割顺式或反式的ssRNA。
图2. 体外CasΦ切割DNA。（A）超螺旋质粒裂解法检测不同间隔区长度的crRNAs重组CasΦ-RNPs活性。（B）以32P同位素的dsDNA为靶点的寡核苷酸裂解分析，用于切割点的定位。（C）切割位点图解。（D）非靶链和靶链 DNA切割效率对比。
由于CasΦ缺乏tracrRNA，导致CasΦ可能需要自身来催化crRNA成熟。为了测试这种可能性，作者将纯化的CasΦ与设计成模拟pre-crRNA结构的底物一起孵育。结果表明，只有在野生型CasΦ存在的情况下，才能观察到与crRNA的26-29nt长重复序列和20nt间隔序列相对应的反应产物。在对照实验中，作者发现pre-crRNA的处理严格依赖于镁离子（图3B），这与其他CRISPR-Cas的RNA处理反应条件不同，表现出一种独特的切割机制。考虑到RuvC结构域切割DNA需要镁，将RuvC结构域失活后发现，CasΦ不能处理pre-crRNA。用磷酸酶处理CasΦ产生的crRNA，变性丙烯酰胺凝胶分析显示，crRNA的迁移率没有变化，这与Cas12a产生的crRNA的迁移率变化不同，这一结果表明，与Cas12a的酸碱催化加工反应相比，CasΦ催化的反应过程中没有生成2′-3′-环磷酸（图3C和3D），说明CasΦ使用单一的RuvC活性位点来进行pre-crRNA处理以及进行DNA切割。
图3. CasΦ在RuvC活性位点内处理pre-crRNA。（A）pre-crRNA底物和加工位置（红色箭头）。（B）镁离子依赖的CasΦ-2和CasΦ-3对pre-crRNA处理结果，RuvC失活的CasΦ（D371A，D394A）没有处理pre-crRNA活性。（C）pre-crRNA底物碱性水解胶图（左和中）。T4多核苷酸激酶（PNK）–磷酸酶对CasΦ和Cas12a裂解产物的处理（右）。(D) CasΦ、Cas12a和PNK磷酸化酶处理的成熟crRNA末端化学式图示。
为了研究CasΦ是否可以用于人类基因组编辑，作者在HEK293细胞中使用与crRNA共表达的CasΦ进行了基因编辑分析，结果发现CasΦ-2和CasΦ-3诱导了egfp基因的靶向破坏（图4A），编辑效率最高可达33%（图4A）。接下来作者测试了CasΦ-2是否可以作为核糖核蛋白（RNPs）被递送至植物原生质体，编辑拟南芥PDS3基因，测序结果显示CasΦ-2引入8~10bp的缺失（图4B）。区别于另外三种特性良好的Cas酶Cas9、Cas12a和CasX使用一个（Cas12a和CasX）或两个（Cas9）活性位点进行DNA切割，CasΦ仅需CasΦ中单个RuvC活性位点便能进行pre-crRNA处理与DNA切割（图4C）。
图4. CasΦ体内基因组编辑。（A）CRISPR-CasΦ-2（CasΦ-3）编辑HEK293细胞内的egfp基因。（B）（左）CasΦ-2与crRNA复合物 RNP介导的拟南芥叶肉原生质体基因组编辑的实验流程图。（右）扩增子测序数据显示PDS3基因中靶区（蓝色）gRNA33最常缺失。（C）Cas9、Cas12a、CasX和CasΦ的pre-crRNA处理和DNA切割差异的对比。
CasΦ中单个RuvC活性位点能够处理crRNA前体和进行DNA切割，这一发现表明，噬菌体基因组的大小受限，可能与噬菌体的大群体规模和比原核生物更高的突变率有关，两者结合导致一个催化中心内化学成分的整合。小尺寸的CasΦ加上其最小的PAM需求，对于基于载体的递送和更广泛的靶向基因组序列都特别有利，因此它将成为CRISPR-Cas家族的一个强大的补充。这种紧凑的蛋白质可能特别适合于工程化和实验室操作，为基因组操纵创造新的功能，也显示了巨大噬菌体作为人类健康发现和生物技术应用的潜力。
Patrick Pausch, Basem Al-Shayeb, Ezra Bisom-Rapp, Connor A. Tsuchida, Zheng Li, Brady F. Cress, Gavin J. Knott, Steven E. Jacobsen, Jillian F. Banfield, Jennifer A. Doudna. CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369, 333–337 (2020).
