bioRxiv丨组织微环境中病毒依赖的免疫调节
作者：李好问
自从20世纪80年代，人类免疫缺陷病毒感染和获得性免疫缺陷综合征（HIV/ADIS）开始大流行，我们所知道的大多数关于HIV在人体以及密切相近的猴免疫缺陷病毒（SIV）在灵长类动物中的生物学研究结论都是通过研究血液样本以及体外病毒侵染细胞后的分子生物学。虽然推动了现代抗逆转录病毒疗法（ART）的发展，但是这种疗法并不能治愈，同时停止疗法后大都会出现病毒反弹。为了了解艾滋病毒持久存在的机制和病理，有必要可视化病毒所在的组织微环境，但目前的方法使得获取病毒所在的组织微环境中细胞的表型图谱特征及量化病毒及分布受到限制。如何通过原位成像获得单细胞空间高丰度化学信息，同步检测蛋白分子和低丰度核酸分子，实现单细胞多模态空间分析，研究细胞微环境内相互作用？
5月25日，斯坦福大学的Garry. P. Nolan教授在预印本在线期刊-《bioRxiv》上发表研究论文《Virus-Dependent Immune Conditioning of Tissue Microenvironments》，报道了基于原位单细胞质谱成像技术研究感染SIV病毒后的淋巴组织微环境，同步检测单细胞蛋白分子和单拷贝的SIV的RNA以及逆转录后的DNA，获得病毒依赖的免疫调控方式、细胞表型图谱、细胞间相互作用以及免疫微环境调控。
为了了解艾滋病毒持续存在的机制和病理，有必要可视化病毒所在的组织微环境。目前研究病毒宿主微环境的方法包括基于sc-RNA seq方法和细胞流式的方法。然而，这些方法需要将细胞从其原生组织环境中取出，丢失了原本的细胞空间信息。免疫组化和原位杂交(ISH)技术等方法能够保留二维空间信息，但受到检测特征数量较少以及荧光团的光谱重叠等限制。尽管空间转录组方法可以实现在二维空间上获得细胞的特征信息，但是目前的常规方法无法实现准确的单细胞分析。随着质谱成像技术的发展，如二次离子质谱（secondary ion mass spectrometry，SIMS）技术以及质谱流式成像技术（imaging of mass cytometry，IMC），不仅可以实现亚细胞空间成像，同时可以获得单细胞多种组学信息。在此，作者采用基于SIMS原理的多路离子成像系统（Mutiplexed Ion Beam Iamging，MIBI），结合所开发的蛋白和核酸原位同步成像的方法（Protein And Nucleic acid IN situ Imaging，PANINI），将SIV感染恒河猴作为模型展开系统性研究。由于一条单链核酸链最多只能携带20个金属离子，而每种蛋白抗体理论上可以携带100多个金属离子。为此，在目标核酸链的成像检测上采用RNA scope的方法进行信号放大（图1A），从而达到单拷贝的检测。为了验证方法的准确性，首先在3D8和CEM细胞的细胞微球切片上进行免疫荧光（IF）和MIBI成像分析（如图1B所示），其中，每个3D8细胞包含一个完整SIV病毒-vDNA的拷贝。由于切片厚度在4-6 μm，因此vDNA检测出的概率占21~29%（如图1C所示）。而IF和MIBI的结果显示了高度的一致性，证明PANINI-MIBI方法的准确性。为了准确分析SIV感染的动态免疫反应，在此设计了包含vDNA和vRNA探针以及31种抗体的panel，对四只感染SIV和两只未感染SIV的恒河猴的淋巴组织进行PANINI-MIBI分析，共计获得470K个细胞的panel参数信息。对SIV感染的恒河猴相邻的淋巴结切片RNA进行ISH或PANINI-MIBI分析(如图1E)，表明后者捕获了SIV病毒(vRNA)的信息、组织形态及细胞分布。如图1E所示，以CD3显示T细胞, CD20显示B细胞，CD11b显示单核细胞,以及CD21显示B细胞和滤泡树突状细胞(FDC)。
图1. PANINI-MIBI实现原位组织中核酸和蛋白的多通道同步检测
为了进行空间单细胞分析，需要对组织空间上的单个细胞进行单元格分割以便于单细胞特征信息的提取。为此，作者采用一种基于deepcell的分割方法-Mesmer进行特征提取，并使用FlowSOM进行细胞聚类及表型识别，如图2A所示。在此，一共鉴定了14种不同的免疫细胞表型，以及相应的细胞参数谱(图2B)。以CD3、CD20、Pax5以及vRNA为例子，MIBI可以清楚的获得其分布及细胞归属(图2C)。基于图2B的细胞表型图谱显示，将MIBI图像中的panel信息换为细胞表型，可以获得整个组织上的14种细胞的空间分布图，如图2D所示。
图2. 非监督计算方法用于原位组织中单细胞特征值的提取及表型识别
接下来，分别对20个组织视野(FOV)、6只猴子以及感染/未感染SIV状态分别进行14种不同细胞的统计归属。发现在SIV感染的动物中，CD4+ T细胞明显减少(图3D)，这是HIV和SIV感染的标志。B细胞数量相对稳定，但其他免疫细胞类型，如NK细胞、CD8+ T细胞、FDC、巨噬细胞等在感染后浸润增加(图3D)。在单个FOV基础上，CD8+ T细胞、NK细胞和巨噬细胞浸润的数量与动物的感染状态高度相关，表明宿主的免疫应答(图3E)。SIV感染组织的B细胞滤泡内FDC上可见广泛的SIV沉积，反映了感染期间FDC的扩张(图1E)。这些反应表明细胞类型之间的高阶协调，超越了单个细胞的表型测量。
图3. 协调免疫组分及SIV感染后的免疫响应
组织微环境可以被认为是各种化学和生物决定因素的积累。组织微环境通常通过识别细胞类型和特征来定性描述。为了更加精准的分析感染状态下细胞间如何作用。在这里，作者采用了一种更经经验的细胞邻域(cell neighbourhoods，CN)方法来定量定义未感染和感染SIV组织的淋巴微环境。为了识别CNs，定义每个锚定细胞周围最接近的19个细胞的细胞表型(即总共20个细胞)作为一个CN，并进行无监督聚类(图4A)。在定义CNs时，细胞的感染状态以及表型的功能标志物(如CD4、Ki-67、CD169和FoxO1)并不被考虑。因此，微环境仅用空间表型模式来定义。使用这种方法，鉴定出了11种具有独特细胞组成的不同CNs，如图4B所示。CN的汇总统计数据(图4C)显示了与图3A-D的类似趋势。
每个FOV的CNs显示CNs的富集，包括CN5、CN7、CN10和CN11。感染SIV的动物中(图4D)，富含CD4+ T细胞的CN6降低(图4C和D)。CN图反映了除表型图外的额外信息维度的组织特性。例如，虽然巨噬细胞在感染SIV和未感染的FOV的表型图中占主导地位，但相同区域的CN图显示了更复杂的情况，存在两种不同的富含巨噬细胞的CNs：CN3和CN8(图4F)。在SIV感染组织中，富含CD8+ T细胞的CN10区域比正常对照组的多。还发现，CD8+ T激活标记物增加，如NFkB-p100、Granzyme B和Ki-67(图4G，左)。在以免疫浸润为特征的CN11中，SIV感染样本中的免疫细胞(CD8+ T细胞和巨噬细胞)及功能标志物水平(NFkB-p100、FoxP3、Granzyme B、Ki-67、FoxO1、MPO、IL-10、CD169和CD36)均高于未感染对照组(图4G)。尽管感染SIV和未感染的动物在两个巨噬细胞相关CNs中巨噬细胞的比例没有显著差异(图4G)，但发现具有(DC-SIGN、FoxO1、IL-10和CD169)功能标志物的巨噬细胞的CN8在SIV感染样本中的显性表达，而具有IL-10功能标志物的巨噬细胞的CN3在感染组织的中仅略高表达。这表明SIV感染诱导巨噬细胞产生组织特异性反应。与M2巨噬细胞抗炎功能相关的标志物DC-SIGN、FoxO1和IL-10的增加反映了慢性病毒感染期间发生的免疫失调(图4G)。CD169的存在反映了外来抗原被巨噬细胞捕获并呈递。因此，在病毒感染期间，由于免疫失调，表型组成和功能标记表达模式都发生了改变
图4. 细胞邻域分析方法实现了病毒感染期间组织微环境的免疫功能剖析
接着，LDA分析从感染和未感染的恒河猴中分离出CNs，并进一步将动物按慢性和急性病毒感染状态进行分层（图5A，B）。通过CD163和FoxO1的M2表型显示的巨噬细胞免疫抑制(图5C，蓝色区域)，CD8+T细胞浸润增加(图5C，黑色区域)，B和T细胞的增殖通过增加Ki-67(图5C，黄色区域)和FDC激活和抗原呈递通过增加CD169和CD11b(图5C，绿色区域)。SIV阳性组织中富含巨噬细胞的CN8，表明通过CD169增加抗原结合，但通过HLA-DR减少呈递(图5D，蓝色区域)，Granzyme B活性降低((图5D，黑色区域)，增加了CD25相关性(图5D，黄色区域)，通过CD169((图5D，绿色区域)增加了B细胞与vRNA的关联和抗原结合。NK-CD4+T细胞和NK-NK细胞的相互作用比未感染的对照组更容易发生(图5E，绿色箭头)。感染后，B细胞-巨噬细胞和巨噬细胞-B细胞的相互作用也略有增加(图5E，紫色箭头)。SIV感染的组织中CN2和CN8比未感染的组织更接近，但这些邻近区域并没有物理上相互作用或重叠。IL-10诱导的B细胞和巨噬细胞免疫抑制微环境。病毒感染诱导了B细胞和巨噬细胞之间相互作用(图5F，紫色箭头)，特别是CN2和CN8之间的联系(图5F，紫色箭头)。
图5. 整体与局部细胞响应和组织重组
上述结果表明，病毒感染诱导了B细胞和巨噬细胞之间的紧密联系(图5E，紫色箭头)，特别是在CN2(B细胞区)和CN8(巨噬细胞)之间的联系。IL-10阳性的细胞主要是CN2中的B细胞和CN8中的巨噬细胞（图6A）。IL-10是一种免疫调节细胞因子，可以激活或抑制免疫系统。
在HIV患者中的几种循环免疫细胞中包括B细胞，IL-10表达均上调。SIV感染后，CN2中的B细胞和CN8中的巨噬细胞IL-10表达均增加(图6B)，提示B细胞和巨噬细胞IL-10表达升高是对病毒感染的宿主反应。从图6C中发现，在CN2内vRNA与IL-10水平呈正相关，而在CN8内则无相关。考虑到IL-10抑制免疫细胞的能力，接下来测量了IL-10水平与CN8中免疫抑制M2巨噬细胞标志物CD163和FoxO1的关系。这些标记物之间存在正相关，提示IL-10触发巨噬细胞M2分化。直观地证实了研究结果，即B细胞和CD163+M2巨噬细胞对SIV感染的反应中IL-10的上调（图6D）。SIV感染是通过B细胞最初感知病毒颗粒(可能通过CD21/CR2参与)，然后吸引附近的巨噬细胞的IL-10的产生，有意诱导免疫抑制和细胞表型。随后FoxO1激活导致更多的IL-10产生，最终M2巨噬细胞分化并产生免疫抑制。
通过分析总共914个SIV感染的细胞。这些细胞以CD4+T细胞为主(69.7%)，其中Treg细胞占10.3%，其余为巨噬细胞(30.3%)。无论潜伏状态如何，感染的细胞都倾向于在B细胞密度高的区域内。潜伏细胞通常比转录活性的感染细胞更接近内皮细胞。vRNA的感染CD4+T细胞附近，FDC、Treg、中性粒细胞和CD8+T细胞的密度高于潜伏CD4+T细胞附近。感染细胞附近的潜伏细胞的基本细胞关系被破坏了。病毒感染细胞之间的相互作用和微环境信号的接近揭示了内在和外部因素在塑造组织微环境中作为病毒感染的效应物或后果的作用。其中功能标记(如CD56、IL10、FoxO1、HLA-DR和CD21)和细胞类型(如内皮细胞、NK、FDCs、中性粒细胞、Treg、B细胞和CD8+T细胞)与SIV感染细胞的距离对潜伏期状态有很大影响
图7. 逆转录病毒潜伏期的宿主决策
该研究创建并优化了PANINI-MIBI的单细胞空间多模态的质谱成像分析方法，对病毒侵入过程中的单拷贝RNA，DNA以及蛋白质进行多通道同步检测成像分析。在原位组织上建立单元格分割模型，利用非监督计算方法用于原位组织中单细胞特征值的提取及表型识别，结合细胞邻域分析方法，实现逐步降维分析，在空间上原位获得SIV感染过程中的细胞表型图谱、细胞间相互作用以及免疫微环境调控。空间多模态质谱成像分析方法也如同空间转录组一样，将在单细胞图谱研究领域发挥空前的重要作用。
Sizun Jiang, et al. Virus-Dependent Immune Conditioning of Tissue Microenvironment. bioRxiv, DOI: https://doi.org/10.1101/2021.05.21.444548.
