NUCLEIC ACIDS RES丨荧光分析单细胞的表观遗传学修饰

作者：汪俊彦

大家好，今天与大家分享一篇发表在Nucleic Acids Research上的文章《Single cell epigenetic visualization assay》，通讯作者是华盛顿大学医学院副教授Oleg Denisenko。Oleg Denisenko教授课题组主要从事肾脏发育和疾病过程中控制基因表达的机制 (表观遗传学) 的研究。

对单细胞表观遗传学修饰的表征任然是一个挑战。目前，很难对同一细胞中单个基因的表观遗传修饰与其转录活性进行相关性分析。为此，作者开发了一种用于定量检测单细胞中靶标基因表观遗传修饰的方法Epigenetic Visualization Assay (EVA)，并且测定了人类细胞系中不同基因和HIV-1 Provirus的5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和组蛋白H3的K9位点的乙酰化修饰 (H3K9Ac) 水平。将EVA与RNA-FISH相结合，作者还同时分析了女性体细胞中XIST基因的表观遗传修饰与其转录活性。

作者利用基因特异性Fish探针，将Detector (红色) 和Sensor (绿色) DNA杂交至靶标基因上，其中Detector DNA的5’端具有磷酸化修饰；通过抗原-抗体之间的特异性结合，作者将碱性磷酸酶 (AP) 偶联至表观遗传学修饰位点；当Detector的邻近位点处无特异性表观遗传学修饰时，其5’端会一直维持着磷酸化修饰；而当Detector的邻近位点处具有特异性表观遗传学修饰时，其5’端的磷酸化修饰会被欧联在抗体上的AP去除；5’-3’ λ-Exonuclease能够选择性酶切5’-磷酸化的双链DNA，而不会作用于5’未磷酸化的双链或单链DNA；因此，λ-Exo不会酶切被AP去除了5’-磷酸化修饰的Detector，使得探针DNA保持着完整的状态，即同时具有红色和绿色荧光；对于维持着5’-磷酸化修饰的Detector，λ-Exo会逐渐酶切Detector直至缺口处，从而释放出标记了绿色荧光的Sensor DNA，从而在感兴趣的位点上只保留着红色荧光 (图1)。

图1. EVA的原理图。

 

为了验证EVA技术，作者首先对HEK293细胞中拷贝数多、甲基化程度高的rDNA的5mC修饰进行了检测。对于三倍体细胞HEK293，其中5条染色体上包含rDNA cluster，即理论上每个细胞中应该能够观察到15个红色荧光团；而作者在细胞中平均观察到了10个红色荧光团，并且每个红色荧光团都有一个共定位的绿色荧光团；将EVA与RNA-FISH相结合，作者还发现ETS区域的甲基化程度与其转录活性无关 (图2)。

图2. rDNA的探针设计。(A) EVA探针 (绿色) 由50个oligos组成，覆盖了2.5 kb的5’端转录间隔区 (5’ ETS)；RNA-FISH探针 (蓝色) 位于5’ ETS同一区域的相反链上。(B) HEK293细胞中rDNA EVA的代表性图片，对照为不加抗体 (No Ab)。比例尺5 μm。

 

图3. (A) XIST基因位点及探针设计；灰色代表外显子区，白色代表内含子区；EVA探针 (绿色) 由85个oligos组成，覆盖4.5 kb，包括基因启动子和外显子1的起始部分；RNA-FISH探针 (蓝色) 识别1号外显子的末端。(B) 人类女性脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 中，XIST EVA及RNA-FISH的代表性荧光图片；比例尺5 μm。(C) 定量分析XIST RNA阳性 (RNA+) 和阴性 (RNA-) 位点处绿色-红色信号强度的比值；图中每个点代表一个细胞，P < 0.05, n = 20。

为了进一步对EVA技术进行验证，作者检测了XIST基因的5mC修饰。在人类女性体细胞中，位于Inactive X染色体 (Xi) 上的XIST基因的甲基化程度低，转录活性高；而位于Active X染色体 (Xa) 上的XIST基因的甲基化程度高，转录活性低；并且，XIST基因转录出的ncRNA会与Xi结合，参与其失活调控，因此，Xi可以被XIST RNA-FISH进行成像分析。作者发现XIST RNA (-) 位点的DNA甲基化信号是RNA (+) 位点的2倍 (P < 0.05)；而在没有λ-Exo处理的对照细胞中，XIST RNA (+/-) 位点的绿色信号强度均相同；这些结果进一步表明绿色荧光信号的强度定量反映了该位点的甲基化修饰程度 (图3)。

随后，作者利用EVA技术进一步对EGR1基因进行了5mC分析。细胞有丝分裂能够激活EGR1基因的表达，即不同状态下的细胞间，EGR1基因的表达具有差异性，作者发现EGR1基因的激活，伴随着其甲基化程度的降低 (图4)。

图4. (A) EGR1基因的探针设计；灰色代表外显子区，白色代表内含子区；EVA探针 (绿色) 由96个oligos组成，覆盖5 kb，包括基因启动子和转录区域。(B) Jurkat细胞中EGR1 EVA的代表性荧光图片；比例尺5 μm。(C) 含有两个绿色荧光团 (di+/+)、一个绿色荧光团 (mono+/-) 和没有绿色信号 (di-/-) 的细胞的比例。

 

为了进一步验证EVA技术的灵敏度，作者对整合至Jurkat细胞基因组的单拷贝HIV provirus基因组的5mC进行了分析。为了评估最低 (0%) 和最高 (100%) 的绿色/红色荧光信号比值，以及噪音对EVA测量中细胞间差异的贡献，作者将绿色荧光标记的Sensor DNA与无标记Sensor DNA以不同比例混合；在无λ-Exo处理的细胞中，绿色/红色的变化是由技术误差引起的，离散系数CV = 0.23 (CV定义为SD/Mean)；而在经λ-Exo处理的细胞中，这种变化是技术噪声和生物学差异共同作用的结果，离散系数CV = 0. 35；作者在在大多数细胞 (> 80 %) 中，可检测出HIV locus的5mC信号，信号强度平均值为最高绿色/红色荧光信号比值的87% (图5)。

图5. (A) HIV基因组示意图和探针设计 (绿色)，EVA探针覆盖HIV-1基因组5’端5 kb区域，在使用的细胞系 (J-Lat) 中，ENV基因发生突变 (红叉)，NEF基因被GFP (绿框) 取代。(B) J-Lat 8.4细胞系中单拷贝HIV-1 provirus基因组5mC修饰的代表性EVA荧光图片。(C) HIV-1 provirus基因组5mC修饰的定量分析；HIV EVA信号的动态范围，绿色荧光标记的Sensor DNA与无标记的Sensor DNA 按不同的比例混合 (0.00, 0.33, 0.67, 1.00)，并且不经过λ-Exo处理，每个点代表一个细胞。

 

图6. (A) HEK293细胞中rDNA处H3K9Ac-EVA的代表性荧光图片；比例尺5 μm。(B) 去乙酰化酶抑制剂 (Trichostatin, TSA) 处理后，H3K9Ac的免疫荧光染色；比例尺5 μm。(C) TSA处理后， H3K9Ac-EVA荧光图片中绿色红色荧光强度的比值；P < 0.001, n = 25。

最后，作者使用EVA技术分析了rDNA中组蛋白H3的K9位点处的乙酰化修饰 (H3K9Ac)。随着去乙酰化酶抑制剂的加入，细胞内H3K9Ac修饰总体增强；并且rDNA处的H3K9Ac修饰也大大增高 (图6)。

作者开发的EVA技术可以监测细胞中等位基因的表观遗传修饰；将EVA与RNA-FISH相结合，可同时分析等位基因的转录活性与其表观遗传学修饰的相关性；但是，对单拷贝基因，作者使用了20 - 96个基因特异性探针，因此，基因的甲基化状态是所有探针覆盖位点的集合，而且EVA一次只能分析一种表观遗传修饰。