韩 达 课 题 组

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NAT BIOMED ENG丨通过便携式设备中的对流PCR进行具有单核苷酸特异性进行高度多重快速DNA检测

作者:侯佳宁

大家好,今天分享的文献是莱斯大学生物工程系David Zhang课题组发表于Nature biomedical engineering的“通过便携式设备中的对流 PCR 进行具有单核苷酸特异性的高度多重快速 DNA 检测”,David Zhang课题组一直以来致力于生物医学成像与仪器:细胞、分子和基因组工程与合成生物学;计算和理论生物工程与生物物理学应用于全球卫生技术领域;转化诊断技术和纳米诊断相关领域。

研究背景:

Ÿ  核苷酸序列的有效读取和精确定量

特定 DNA 序列的检测是精准医学的核心,从病原体识别到人类遗传疾病的风险评估,再到疾病预后,都需要对DNA序列信息进行读取和定量,随着对疾病基因组学理解的提高,DNA 诊断系统将促进将这些科学知识转化为可操作的临床实践,这些系统同时需要具有快速、负担得起、灵敏、大规模多路复用、定量和易于操作的特点。

    现有核酸分析系统的对比:

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  自 2000年代初以来,DNA 检测技术已分为大规模多重但缓慢的系统(下一代测序 (NGS) 和微阵列),或快速但低多重化测定(定量 PCR (qPCR) 和等温扩增)。缓慢但强大或快速但有限的权衡的两个值得注意的例外是 Biofire FilmArray 多重 PCR 系统和 Oxford Nanopore 高通量测序系统。然而,这两种技术不能提供准确的量化,也不能可靠地识别与遗传和代谢风险评估、药物遗传药物剂量、癌症治疗选择和对传染病的抗菌素耐药性相关的SNP差异。

Ÿ 对流PCR

对流 PCR (convective PCR, CPCR)是在一个封闭的空间中,维持其上下表面温度保持不变,产生热流体上升冷流体下降的一种现象,由于温度引起的密度差异,对流 PCR 使用流体的被动运动来实现 PCR 反应混合物的热循环,是一种将上下温差引起空间内流体密度变化引起的热对流应用于 DNA 扩增的一种技术。

单一热源驱动的对流 PCR 扩增:反应管底部液体因受热会导致密度减小,此时在浮力的作用下液体向反应管上方运动,但上升的过程中液体的温度逐渐降低,密度增大,直至到达反应管顶部时,在自身重力的作用下液体开始下沉,当到达反应管底部时,会再次进行下一次循环。

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通过反应管内液体的热对流运动,PCR 试剂可以反复经历不同的温度变化从而完成 PCR 扩增。当 PCR 试剂位于反应管底部时,由于温度较高,DNA 双链变性形成 DNA 单链;当 PCR 试剂流动至反应管顶部时,在较低温度条件下,PCR 试剂中的引物与 DNA 单链特异性结合,即退火过程;随后 PCR 试剂下沉,在反应管中部时,DNA 聚合酶完成延伸反应。这样,液体进行一次对流便可完成 PCR 反应的一个循环。

整体设计:

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在环形 PCR 系统中,作者设计了一个芯片,其中包括一个环形(甜甜圈形)反应室,其中装有 DNA 样品和 PCR 试剂。然后将芯片密封并在一侧垂直安装到 95 ℃ 的加热器,另一侧安装到 60 的加热器。95 区域的流体密度变小并上升,随后移动到 60 区域,在那里冷却并由于密度增加而下降到腔室底部。在芯片反应室的内表面,打印了一个预淬灭的 DNA 微阵列,基于探针的进行多重读出。一旦将加载的芯片安装在加热器上,PCR 反应开始,使用外部相机定期拍摄微阵列区域的照片。在反应结束时,与 DNA 扩增子杂交的探针变亮。环形 PCR 扩增与探针杂交同时发生,与标准微阵列不同,可以实时跟踪扩增反应的进程。实时读数允许基于荧光显着增加的时间进行稳健和准确的 DNA 目标量化,但也有标准微阵列的终点荧光定量不太稳定的问题。

结果与讨论:

1. 特异性、速度、灵敏度和定量动态范围

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对流 PCR 先前未进入主流使用,部分原因是较差的温度均匀导致显着的引物二聚体形成和非特异性基因组扩增。因此,构建基于对流的大规模多重 qPCR 检测的首要任务之一是确保 PCR 扩增特异性。通过在 PCR 芯片中设计一个甜甜圈形反应室,去除了大部分死体积,并且能够在人类 gDNA 上实现与商业 Bio-Rad CFX96 仪器相似的 PCR 特异性(图a)。对于提高环形 PCR 室中的扩增速度,环形 PCR 中的流体循环速度受反应室厚度的影响,因为在层流中,表面附近的流体速度接近于零。平均循环速度在大约 360 µm 的腔室厚度处趋于稳定。在此厚度下,腔室体积约为 25 µl,与商业 qPCR 反应体积一致。循环时间为 25 秒,标准 40 循环 PCR 方案可在 20 分钟内完成。

为了评估环形 PCR 检测的扩增速度和动态范围,使用不同数量的 NA18537 人类细胞系 gDNA运行环形芯片,范围从 10 个单倍体基因组拷贝到105个单倍体基因组拷贝。三次重复实验显示一致的过渡时间 ( Tt ),定义为荧光首次超过 0.4 RFU 阈值的时间。所有三个阴性对照样品(水)都没有超过阈值的点荧光,证实了特异性 PCR 扩增和探针检测。

在环形 PCR 芯片上同时对小鼠和人类 DNA 进行定量,以表征由于存在可变数量的背景 DNA 而对定量准确性的潜在干扰(图e,f)。观察到小鼠 DNA 与人类 DNA 的化学计量比范围为 12.8 到 0.1范围内人类 DNA的Tt 值基本上不受影响。以上结果表明环形 PCR 检测可用于多重基因表达谱分析。

2. 各个点位置测试的独立性

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为了在诊断环境中实现这些多路复用功能,观察到的结果必须在不同点之间具有可重复性和一致性。为了表征点间一致性,作者构建了一个 48 点环形 PCR 芯片,其中包括针对 3 个人类基因、3 个大鼠基因和 3 个小鼠基因的探针的五重重复点,以及 2 个阳性对照和 1 个阴性对照(图a)。观察到,尽管终点点荧光强度存在显着差异,怀疑主要是由于光照不均匀,但对于九个基因中的每一个,Tt 的值在所有五个重复点中都非常保守。

3. SNP基因分型

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SNP 是人类基因组中的自然变异;在人类基因组中已经报道了超过 1 亿个不同的 SNP 位点。全基因组关联分析已经发现宽范围的SNP与糖尿病的类型相,神经变性疾病,遗传性乳腺癌和结肠直肠癌,和冠心病等疾病风险相关。

目前,微阵列是 SNP 基因分型应用的首选技术,因为它具有大规模多路复用、高度自动化和可接受的经济性。然而,使用微阵列分析样品大约需要 24 小时。此外,由于需要三台大型专用仪器进行杂交、洗涤和成像,因此需要将样品运送到中央实验室进行分析,从而使总周转时间增加了更多天数。对于 SNP 基因分型应用需要快速进行的药物遗传学研究,基于个体化药物代谢率,使用 SNP 基因分型信息来告知药物剂量,等,3-7天的传统方法分析时间不能满足要求。

对于 SNP 基因分型,作者使用 X 探针架构来实现基于探针的单核苷酸区分,同时限制化学修饰 DNA 的试剂成本。对于每个 SNP 位点,设计了两个单独的表面结合 X 探针,每个等位基因一个。在 SNP 位点纯合的人类 DNA 样本将只有相应的等位基因点亮起,而杂合的样本将两个点都亮起(图b)。

为了展示通过环形 PCR 检测 SNP 基因分型的验证和准确性,作者构建了一个 30 点阵列,对应于 15 个不同人类 SNP 位点的备用等位基因。最初的面板测试显示,3 个不同的人类细胞系 gDNA 样本的所有 15 个基因座的 SNP 基因型调用正确。接下来,在知情同意的情况下,使用图e中所示的生产原型仪器,将该面板应用于来自母亲、父亲和孩子的家庭三人组的口腔拭子样本。样品的终点荧光图像显示在图d 中,但像往常一样,SNP 基因型调用是使用基于时间的荧光轨迹进行的。

4. 重现性

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为了验证环形 PCR 系统的稳健性和高度复用面板的可重复性,作者对人类基因组的不同区域进行了 19 重环形 PCR 面板的重复实验。对于 3 个输入 DNA 浓度(2 ng、20 ng 和 200 ng)中的每一个,进行 20 个重复芯片,总共 60 个芯片。尽管阈值时间Tt 存在一些可变性,但结果在数量上与观察到的Tt 标准偏差一致,在 19 个位点 × 3 浓度下,平均值小于 0.3 分钟。与 qPCR 一样,不同的引物具有不同的每步 PCR 产量,因此对引物序列进行标准优化以实现更均匀的Ct qPCR 上的(定量循环阈值)值也可能导致环形 PCR 上更一致的Tt 值。此外,输入 DNA 量减少 10 倍时,Tt 值的相对变化遵循预期的线性趋势(图b),表明环形 PCR 具有进行多重定量的能力。

总结

环形 PCR 系统使用封闭、便携式和经济实惠的仪器,从单个样品中实现了许多 DNA 目标的快速、灵敏和定量检测。最低输入 DNA 是 35 pg 的人类 gDNA,对应于 10 个单倍体拷贝。这项工作中的研究仅限于 16 到 48 个点的阵列,但探针打印数量是可以进行拓展的,作者通过检测人类基因组 DNA 中的 20 个基因组位点和 30 个单核苷酸多态性来展示其性能样本和临床分离株中的 15 种细菌。用于快速和高度多重检测核酸的便携式设备可以在即时诊断中提供优势。

同时,虽然该设备可以实现多重PCR的边扩增边检测,但预先淬灭阵列要求了所有进行扩增并被检测到的DNA必须为已知的并且将其设置于芯片上,属于检测方法的创新,也有一定的荧光恢复光照不稳定现象。但是对于对流PCR的成功改进,并且在SNP测定上有一定优势。

Khodakov, D., Li, J., Zhang, J.X. et al. Highly multiplexed rapid DNA detection with single-nucleotide specificity via convective PCR in a portable device. Nat Biomed Eng (2021). https://doi.org/10.1038/s41551-021-00755-4

 

2021年7月17日 20:59
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